VEGF抑制肝硬化大鼠肝竇毛細(xì)血管化的研究纖維血管鏡技術(shù)在動(dòng)脈閉塞性疾病中的應(yīng)用研究.pdf

1、研究背景： 肝竇毛細(xì)血管化包括內(nèi)皮細(xì)胞的失窗孔和基底膜形成，是肝硬化過(guò)程中的重要病理改變。正常肝竇內(nèi)皮細(xì)胞擁有跨肝竇內(nèi)皮的窗孔，并且缺乏基底膜。窗孔、吞飲小泡及跨膜通道共同控制組織與血液之間的物質(zhì)交換。有窗孔的肝竇內(nèi)皮的結(jié)構(gòu)完整性是維持肝竇和肝細(xì)胞間體液、溶質(zhì)、大分子顆粒、和代謝產(chǎn)物交換的基本保證。盡管導(dǎo)致肝硬化的原因多樣，但共有的一點(diǎn)是內(nèi)皮的失窗孔和基底膜形成。正常濾過(guò)屏障的消失將導(dǎo)致肝細(xì)胞和肝竇血液間的物質(zhì)交換障礙。

2、 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)可誘導(dǎo)血管發(fā)生、內(nèi)皮細(xì)胞增殖及提高血管通透性，在調(diào)節(jié)血管生成方面起重要作用。近來(lái)，VEGF已被證實(shí)可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的窗孔形成，增加內(nèi)皮細(xì)胞通透性。通過(guò)點(diǎn)注射VEGF，在正?；蛘吒斡不拇笫蟾闻K中促進(jìn)了肝竇周圍新生血管的形成。 既然內(nèi)皮細(xì)胞的失窗孔和基底膜形成導(dǎo)致了肝竇血液和肝細(xì)胞間的物質(zhì)代謝紊亂。因此改善肝竇內(nèi)皮細(xì)胞功能可以減輕肝硬化。同時(shí)，VEGF具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞窗孔形成和提高滲透性的作用。據(jù)此，我

3、們進(jìn)行了VEGF轉(zhuǎn)基因治療肝硬化大鼠肝竇毛細(xì)血管化的初步研究。 目的： 1、分離培養(yǎng)大鼠肝臟細(xì)胞，以EGFP/VEGF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染原代肝細(xì)胞，通過(guò)觀察EGFP(綠色熒光蛋白)和VEGF(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)的表達(dá)，證實(shí)細(xì)胞轉(zhuǎn)染的有效性。 2、分離培養(yǎng)大鼠肝竇內(nèi)皮細(xì)胞，以EGFP/VEGF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝竇內(nèi)皮細(xì)胞，觀察VEGF對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞窗孔的影響。 3、以硫代乙酰胺復(fù)制肝硬化大鼠模型，電鏡觀察肝竇毛細(xì)血管化在肝硬化發(fā)

4、生過(guò)程中的作用。 4、EGFP/VEGF質(zhì)粒通過(guò)門靜脈轉(zhuǎn)染肝硬化大鼠活體肝臟，研究VEGF對(duì)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞化的影響。通過(guò)血管生成基因芯片探討VEGF抑制肝竇內(nèi)皮細(xì)胞化的機(jī)制。方法： 1、膠原酶消化法獲取大鼠肝臟細(xì)胞，EGFP/VEGF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染原代肝細(xì)胞，免疫熒光顯微鏡觀測(cè)EGFP的表達(dá)，VEGF免疫組織化學(xué)染色觀察VEGF的表達(dá)。 2、膠原酶消化法獲取大鼠肝竇內(nèi)皮細(xì)胞，EGFP/VEGF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染原代肝竇內(nèi)皮細(xì)胞，掃

5、描電鏡及透射電鏡觀察轉(zhuǎn)染前后內(nèi)皮細(xì)胞窗孔數(shù)量的變化。 3、40只大鼠參與造模，采取前5周使用0.03％的硫代乙酰胺，后5周使用0.04％硫代乙酰胺作為其飲用水，共誘導(dǎo)10周成肝硬化模型。對(duì)成模大鼠測(cè)定門靜脈壓力，取硬化后肝臟標(biāo)本，并門靜脈內(nèi)注入EGFP/VEGF質(zhì)粒150μg。飼養(yǎng)三周后重復(fù)測(cè)定門靜脈壓力，處死全部大鼠，取肝組織標(biāo)本。行透射電子顯微鏡觀察轉(zhuǎn)基因前后肝臟超微結(jié)構(gòu)變化，統(tǒng)計(jì)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞窗孔數(shù)量及門靜脈壓力在轉(zhuǎn)基因前后

6、的變化。取肝臟組織行基因芯片實(shí)驗(yàn)，比較轉(zhuǎn)基因前后血管生成相關(guān)基因的變化。 結(jié)論： 1、EGFP/VEGF質(zhì)粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染，可使肝臟細(xì)胞分泌VEGF增多，并可使肝竇內(nèi)皮細(xì)胞窗孔直徑增大、數(shù)量增多。 2、肝竇毛細(xì)血管化在肝硬化門脈高壓發(fā)生中起重要作用，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞窗孔直徑減小并數(shù)量減少，內(nèi)皮細(xì)胞下基底膜形成使肝細(xì)胞與外界物質(zhì)交換減少，導(dǎo)致細(xì)胞缺氧、代謝產(chǎn)物聚集，肝細(xì)胞壞死，是門脈高壓發(fā)生過(guò)程中基本的病理生理改變。

7、 3、EGFP/VEGF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，可通過(guò)VEGF的表達(dá)促進(jìn)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞窗孔增加，基底膜降解，因此肝細(xì)胞與外界物質(zhì)的交換恢復(fù)，肝細(xì)胞再生，門脈壓力降低。VEGF導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞的窗孔化和通透性的增加在抑制肝竇毛細(xì)血管化方面起重要作用。 4、VEGF轉(zhuǎn)基因，是通過(guò)眾多生長(zhǎng)因子的交互作用，促進(jìn)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)，基底膜降解的，其中包括：血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子Figf(VEGFD)、Pgf、Vegf、Vegfb、Vegfc；Ephrin家族E

8、fna2(Ephrin A2)、Efnb2(Ephrin B2)、Ephb4(Ephrin B4)；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子Fgf1(aFGF)、Fgf6和其受體Fgfr3；血小板源性生長(zhǎng)因子和受體：Pdgfa、Pdgfb和其受體Pdgfrb，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子和受體Tgeo1、Tgfb2、Tgfb3和其受體Tgfbr2；其他生長(zhǎng)因子：組織生長(zhǎng)因子Ctgf、表皮生長(zhǎng)因子Egf,胰島素樣生長(zhǎng)激素1Igf1、Grol。 門靜脈高壓透射電鏡掃描電

9、鏡基因芯片 目的： (1)通過(guò)與光鏡下對(duì)比，研究血管鏡對(duì)實(shí)驗(yàn)性兔腹主動(dòng)脈粥樣硬化嚴(yán)重程度診斷的準(zhǔn)確性。(2)通過(guò)對(duì)比血管鏡輔助下的動(dòng)脈取栓與傳統(tǒng)取栓術(shù)的遠(yuǎn)近期通暢率，探索血管鏡在動(dòng)脈取栓術(shù)中的應(yīng)用方法。 方法： 新西蘭成年大白兔，高脂飼料喂養(yǎng)3周后建立球囊損傷模型，繼續(xù)高脂飼養(yǎng)10周即成腹主動(dòng)脈粥樣硬化模型。選擇腹主動(dòng)脈分叉處至腎動(dòng)脈平面為研究對(duì)象，血管鏡下每隔1CM截取一幅圖像，共選取5幅圖像。血管鏡評(píng)

10、估指標(biāo)：每幅圖片中斑塊數(shù)量(0，0分；1-3，1分；4-6，2分；7-9，3分；＞10，4分)。斑塊顏色分級(jí)(白色0分；淺黃色1分、黃色2分、深黃色3分)。斑塊所占圖像面積(0，0分：＜10％，1分；11％-30％，2分；30％-50％，3分；＞50％，4分)。統(tǒng)計(jì)粥樣硬化積分，板塊數(shù)量積分+板塊顏色積分+斑塊面積積分，總分0-11分。按得分大小對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化程度排序。光鏡下評(píng)估粥樣硬化程度的不同：每只動(dòng)物選擇腹主動(dòng)脈分叉處至腎動(dòng)脈平面

11、為研究對(duì)象，每隔1CM切取動(dòng)脈橫斷面做HE染色。共切5層，得到5個(gè)HE切片。統(tǒng)計(jì)斑塊處內(nèi)膜厚度占動(dòng)脈壁厚度的百分比，斑塊所占內(nèi)膜表面積的百分比。取二者平均值作為光鏡下動(dòng)脈硬化指標(biāo)。按此指標(biāo)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化程度排序。采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，研究血管鏡下與光鏡下的分析結(jié)果的相關(guān)性。 選擇股動(dòng)脈栓塞的病人62例，所有患肢均經(jīng)股動(dòng)脈切開(kāi)，F(xiàn)orgarty球囊導(dǎo)管取栓，隨即分為A組28例肢體，取栓完成后行數(shù)字減影血管造影技術(shù)(Di

12、gitalSubtraction Angiography,DSA)，統(tǒng)計(jì)DSA造影所能發(fā)現(xiàn)的需要再次干預(yù)的病例數(shù)。B組40例肢體，在纖維血管鏡監(jiān)視下取栓，以血管鏡下無(wú)血栓殘留，無(wú)長(zhǎng)段內(nèi)膜撕裂作為取栓滿意的判定結(jié)果。統(tǒng)計(jì)血管鏡所能發(fā)現(xiàn)的需要再次干預(yù)的病例數(shù)。對(duì)A、B兩組取栓異常的檢出率行x2檢驗(yàn)，比較DSA與血管鏡對(duì)異常檢出率的差異。并對(duì)所有病人進(jìn)行隨訪，1個(gè)月為近期通暢率，2年作為遠(yuǎn)期通暢率，比較AB兩組病人近遠(yuǎn)期通暢率的差異，對(duì)結(jié)果進(jìn)