米諾環(huán)素對(duì)視網(wǎng)膜感光細(xì)胞保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、隨著感染性眼病的控制，視網(wǎng)膜色素變性已經(jīng)成為主要的致盲性眼病之一，其發(fā)病率約1/4000，全球患病者超過一百萬。雖然針對(duì)病因的基因治療是解決問題的根本，但由于RP的高度遺傳異質(zhì)性，使得針對(duì)特定基因的治療手段不具有普遍性。而由于細(xì)胞凋亡已被證實(shí)為不同遺傳型RP中感光細(xì)胞死亡的共同通路。因此，抗凋亡治療成為RP治療的有力的作用位點(diǎn)。 米諾環(huán)素是屬于四環(huán)素家族的廣譜、二代半合成抗菌素，近年來由于在其藥效學(xué)上的新發(fā)現(xiàn)而受到神經(jīng)科學(xué)者的關(guān)

2、注。人們首先注意到米諾環(huán)素的抗炎作用：對(duì)腦缺血性病變，米諾環(huán)素的應(yīng)用可減輕病灶處小膠質(zhì)細(xì)胞的活化和聚集。進(jìn)一步的研究表明，米諾環(huán)素對(duì)慢性神經(jīng)變性性疾病也具有治療作用，主要表現(xiàn)為抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。鑒于大量動(dòng)物模型的研究基礎(chǔ)，以及米諾環(huán)素多年來在抗菌方面的應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)，目前已經(jīng)展開了針對(duì)肌萎縮性側(cè)索硬化、多發(fā)性硬化和亨廷頓病的臨床試驗(yàn)。一些前期的小樣本研究表明米諾環(huán)素是安全并且有效的。 睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子最初是從雞的眼球抽提物中分離出來

3、的一種能促進(jìn)雞胚睫狀神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活的蛋白質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，CNTF對(duì)多種神經(jīng)元均具有保護(hù)作用。對(duì)于其作用機(jī)制，目前仍未能確定。已經(jīng)提出的理論包括：抑制谷氨酸的興奮性毒性；調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞；活化神經(jīng)保護(hù)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等。 為評(píng)估米諾環(huán)素是否具有對(duì)視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的保護(hù)作用，本研究首先觀察米諾環(huán)素對(duì)體外培養(yǎng)的視網(wǎng)膜原代神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用，再以視網(wǎng)膜變性的動(dòng)物模型--視網(wǎng)膜慢變性小鼠作為研究對(duì)象，觀察米諾環(huán)素治療的效果。此外，我們還嘗試將外源

4、性的神經(jīng)保護(hù)藥物與內(nèi)源性的神經(jīng)營養(yǎng)因子結(jié)合應(yīng)用，即在使用米諾環(huán)素的同時(shí)，通過基因轉(zhuǎn)移增加CNTF的表達(dá)。比較聯(lián)合治療與單純米諾環(huán)素應(yīng)用的效果，分析聯(lián)合治療的可行性和必要性。 第一部分視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)及凋亡模型的建立 目的：原代培養(yǎng)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞，建立神經(jīng)細(xì)胞凋亡模型。 材料和方法：取生后7天SD乳鼠，摘取眼球后分離視網(wǎng)膜，胰酶消化后接種于包被多聚賴氨酸的培養(yǎng)皿中。接種次日加入阿糖胞苷抑制膠質(zhì)細(xì)胞生長。細(xì)胞生長5

5、～7日行免疫組化鑒定，分別檢測NSE、Rhodopsin、GFAP和Lectin的表達(dá)。神經(jīng)細(xì)胞凋亡模型采用1000M和1mM的谷氨酸誘導(dǎo)，MTT法檢測細(xì)胞存活率。以AnnexinV/PI的流式細(xì)胞儀檢測評(píng)估細(xì)胞凋亡。 結(jié)果：接種24小時(shí)后，大部分細(xì)胞貼壁生長。絕大部分細(xì)胞呈近圓形，胞體較小，折光性好。另可見小部分細(xì)胞呈不規(guī)則形，胞體大而扁平，生長于第一類細(xì)胞的下方。經(jīng)免疫組化鑒定，前者為神經(jīng)細(xì)胞，后者為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。通過兩種抗

6、體的雙染，可見神經(jīng)細(xì)胞中大部分為視桿細(xì)胞。培養(yǎng)細(xì)胞中約80％為視桿細(xì)胞；10％為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，偶見小膠質(zhì)細(xì)胞。100μM和1mM的谷氨酸都可引起細(xì)胞的死亡，MTT法得到的光密度均值：正常對(duì)照組，0.093±0.008；低濃度谷氨酸組，0.043±0.006；高濃度谷氨酸組，0.037±0.008。正常組與兩個(gè)谷氨酸組之間存在顯著性差異，兩個(gè)谷氨酸組之間不存在顯著性差異。采用1mM谷氨酸作用1小時(shí)后，AnnexinV/PI檢測可見凋亡細(xì)胞

7、比例由0.3％升高至7.7％。 結(jié)論：采用酶消化法原代培養(yǎng)視網(wǎng)膜細(xì)胞，并以阿糖胞苷抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，可得到以神經(jīng)細(xì)胞為主的視網(wǎng)膜細(xì)胞。100μM和1mM谷氨酸均可有效誘發(fā)凋亡，其中1mM谷氨酸作用1小時(shí)后，即可檢測到神經(jīng)細(xì)胞凋亡顯著增多。 第二部分米諾環(huán)素對(duì)體外培養(yǎng)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的抗凋亡作用 目的：觀察米諾環(huán)素對(duì)抗谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡的效果，分析其作用機(jī)制。 方法：原代培養(yǎng)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞，分為正常對(duì)照

8、組、米諾環(huán)素對(duì)照組、谷氨酸對(duì)照組和米諾環(huán)素治療組。干預(yù)1小時(shí)后行AnnexinV/PI流式細(xì)胞儀檢測，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)量；RT-PCR檢測caspase-3的mRNA水平，流式細(xì)胞儀檢測Rh123評(píng)估線粒體膜電位。干預(yù)12小時(shí)后行MTT檢測細(xì)胞活性；取細(xì)胞培養(yǎng)上清做一氧化氮合酶(NOS)的活力單位檢測。 結(jié)果：干預(yù)1小時(shí)后，AnnexinV/PI流式細(xì)胞儀檢測凋亡細(xì)胞比例：正常對(duì)照組，5.1％；米諾環(huán)素對(duì)照組，4.3％；谷氨酸對(duì)照

9、組，15.2％；米諾環(huán)素治療組，8.3％。Caspase3各組水平：正常對(duì)照組，0.28±0.07；米諾環(huán)素對(duì)照組，0.36±0.06；谷氨酸對(duì)照組，0.92±0.11；米諾環(huán)素治療組，0.58±0.08。干預(yù)12小時(shí)后，MTT檢測各組細(xì)胞吸光度均值：正常對(duì)照組，0.093±0.008；米諾環(huán)素對(duì)照組，0.099±0.012；谷氨酸對(duì)照組，0.0378±0.008；谷氨酸+米諾環(huán)素治療組，0.08775±0.016。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，正常組與治療

10、組之間無顯著性差異，谷氨酸對(duì)照組與其他各組之間均有顯著性差異。流式細(xì)胞儀檢測Rh123，得出各組陽性率。正常對(duì)照組，67.1％；米諾環(huán)素對(duì)照組，54.2％；谷氨酸對(duì)照組，27.5％；米諾環(huán)素治療組，32.4％。NOS活力單位檢測，以其他各組與正常組的比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，均數(shù)為：正常對(duì)照組，1；米諾環(huán)素對(duì)照組，0.987±0.219；谷氨酸對(duì)照組，1.513±0.472；米諾環(huán)素治療組，1.176±0.259。其中谷氨酸對(duì)照組與其他三組之間有顯

11、著性差異。 結(jié)論：20μM米諾環(huán)素可顯著減輕谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制與抑制caspase-3的表達(dá)，穩(wěn)定線粒體膜電位，以及抑制NOS活性有關(guān)。 第三部分米諾環(huán)素對(duì)rds鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞凋亡的拮抗作用 目的：觀察米諾環(huán)素腹腔注射對(duì)視網(wǎng)膜慢變性小鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞凋亡的治療效果。 材料和方法：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為3組。米諾環(huán)素治療組與陽性對(duì)照組為日齡匹配的rds小鼠。米諾環(huán)素組于生后7天開始腹腔注射米諾環(huán)素

12、，每日50mg/kg。陽性對(duì)照組小鼠不作干預(yù)。正常對(duì)照組為日齡匹配的C3B小鼠。三組小鼠分別于P18，P25，P35及P45時(shí)處死，摘取眼球。檢測指標(biāo)如下：P18的視網(wǎng)膜切片原位細(xì)胞凋亡檢測；P45的視網(wǎng)膜切片外核層厚度測量；各時(shí)間點(diǎn)視網(wǎng)膜切片HE染色；各時(shí)間點(diǎn)的視網(wǎng)膜切片F(xiàn)4/80免疫組化檢測。 結(jié)果： 1.原位細(xì)胞凋亡檢測：正常對(duì)照組視網(wǎng)膜未見陽性細(xì)胞。治療組與陽性對(duì)照組的視網(wǎng)膜切片均可在外核層發(fā)現(xiàn)陽性染色細(xì)胞，治療

13、組較陽性對(duì)照組數(shù)量明顯減少。 2.形態(tài)學(xué)觀察：正常對(duì)照組視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)完整，外核層細(xì)胞有9～10層，其外側(cè)依次為感光細(xì)胞內(nèi)節(jié)與外節(jié)。治療組及陽性對(duì)照組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)相似，各時(shí)間點(diǎn)視網(wǎng)膜外節(jié)均缺如；外核層細(xì)胞層數(shù)隨小鼠日齡增長逐漸減少。其中陽性對(duì)照組由P18的9～10層減少到P45的6～7層；而治療組視網(wǎng)膜在P45時(shí)有7～8層。P45時(shí)，距視乳頭200μm處ONL厚度：治療組，40.85±2.89μm；陽性對(duì)照組，33.31±4.47

14、μm；正常對(duì)照組，48.89±2.18μm。距視乳頭600pro處ONL厚度：治療組，39.90±3.19μm；陽性對(duì)照組，28.96±3.34μm；正常對(duì)照組，35.62±2.68μm。治療組與陽性對(duì)照組間有顯著性差異。 3.視網(wǎng)膜F4/80免疫組織化學(xué)檢查：正常對(duì)照組可見視網(wǎng)膜內(nèi)層散在陽性細(xì)胞。陽性對(duì)照組可見分布于視網(wǎng)膜各層的陽性染色，視網(wǎng)膜下腔亦見陽性細(xì)胞。治療組視網(wǎng)膜陽性染色相對(duì)較少，大部分局限于視網(wǎng)膜內(nèi)層，偶見于外叢狀

15、層，外核層及視網(wǎng)膜下腔均未見陽性細(xì)胞。 結(jié)論：米諾環(huán)素治療可減少視網(wǎng)膜慢變性小鼠的感光細(xì)胞凋亡數(shù)量，延緩?fù)夂藢幼儽〉陌l(fā)展。 第四部分米諾環(huán)素聯(lián)合CNTF基因轉(zhuǎn)移對(duì)rds鼠感光細(xì)胞凋亡的拮抗作用 目的：觀察米諾環(huán)素與CNTF基因轉(zhuǎn)移聯(lián)合應(yīng)用拮抗rds鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞凋亡的效果，并與單純應(yīng)用米諾環(huán)素的效果進(jìn)行比較，探討聯(lián)合治療的必要性。 材料和方法：rds小鼠于P7開始每日腹腔注射米諾環(huán)素50mg/kg。P1

16、0小鼠右眼接受單次的玻璃體腔注射攜帶睫狀神經(jīng)基因的重組腺相關(guān)病毒，作為聯(lián)合治療組；左眼不做處理，作為單一治療組。兩組動(dòng)物分別于P18，P25，P35及P45時(shí)處死，摘取眼球。檢測指標(biāo)如下：RT-PCR檢測CNTF的mRNA表達(dá)；免疫組化檢測CNTF在視網(wǎng)膜的表達(dá)；P18的視網(wǎng)膜切片原位細(xì)胞凋亡檢測；P45的視網(wǎng)膜切片外核層厚度測量；各時(shí)間點(diǎn)視網(wǎng)膜切片HE染色。 結(jié)果： 1.RT-PCR：除P18兩組間無顯著性差異外，轉(zhuǎn)染

17、AAV-CNTF的聯(lián)合治療組CNTF的mRNA表達(dá)較單一治療組顯著增高，表明轉(zhuǎn)染的基因在mRNA水平得到有效表達(dá)。 2.視網(wǎng)膜CNTF免疫組織化學(xué)檢查：單一治療組陽性染色基本見于視網(wǎng)膜內(nèi)層，其中神經(jīng)纖維層染色呈短索狀，與視網(wǎng)膜平面平行；內(nèi)叢狀層染色呈細(xì)條狀，與視網(wǎng)膜平面垂直；內(nèi)核層散在陽性細(xì)胞。隨時(shí)間延長無明顯變化。聯(lián)合治療組可見視網(wǎng)膜陽性染色分布與單一治療組相近，但數(shù)量較多，且隨時(shí)間延長逐漸增多，提示CNTF表達(dá)大致位于神經(jīng)膠

18、質(zhì)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后表達(dá)增加。 3.P45時(shí)，距視乳頭200μm處ONL厚度：單一治療組，40.85±2.89μm；聯(lián)合治療組，45.39±3.32μm。距視乳頭600μm處ONL厚度：單一治療組，39.90±3.19μm；聯(lián)合治療組，41.48±2.80μm。200μm處兩者有顯著性差異。 結(jié)論：AAV-CNTF轉(zhuǎn)染后可顯著提高視網(wǎng)膜CNTF的表達(dá)；米諾環(huán)素與CNTF聯(lián)合應(yīng)用，可有效延緩rds鼠視網(wǎng)膜變性，其效果優(yōu)于米諾環(huán)素