工程化CTL凝膠預防直腸癌術(shù)后復發(fā)研究.pdf

1、研究背景:目前，直腸癌已成為全世界范圍內(nèi)最為常見的一種惡性腫瘤，在中國的發(fā)病率近年來也迅速增長，成為城市發(fā)病率第一的惡性腫瘤。直腸癌手術(shù)治療是對其根治的最有效方法，然而對部分低位直腸癌的手術(shù)卻陷入兩難境地，對于生活質(zhì)量要求較高的患者，腹會陰聯(lián)合根治術(shù)造成身體、心理創(chuàng)傷往往難以接受，而保肛手術(shù)存在根治不徹底、腫瘤復發(fā)率高的風險，術(shù)后常規(guī)的放、化療又存在副作用大、術(shù)區(qū)粘連的弊端。我們希望能夠找到一種術(shù)中應用的輔助治療手段，在局部切除的同時，

2、能夠降低腫瘤的復發(fā)，消滅殘存的惡性腫瘤細胞，同時還能減少放療所帶來的副作用。目前，過繼細胞免疫治療已成為治療惡性腫瘤的第四種療法，在臨床得到廣泛應用，也越來越凸顯出其良好療效，在綜合治療惡性腫瘤疾病中顯現(xiàn)出巨大作用。該方法在提高患者自身免疫防御力及殺傷力的同時，積極消滅術(shù)后及放化療后血液、組織內(nèi)殘留的惡性腫瘤細胞，以實現(xiàn)降低惡性腫瘤復發(fā)率、延長生存期的目標，有著副作用小、特異性強的優(yōu)點。在體外培養(yǎng)的細胞毒性T淋巴細胞，具備靶向殺傷腫瘤細

3、胞特點，有效控制腫瘤生長、復發(fā)及轉(zhuǎn)移。國內(nèi)外對于CTL細胞連續(xù)殺傷靶細胞的高效特點、抗原特異性特點、自身MHC限制性特點有很多研究，在多項臨床試驗中有穩(wěn)定的抗腫瘤效果，靜脈回輸CTL細胞在臨床也有實際應用。而將CTL細胞與含有大量水分利于營養(yǎng)物質(zhì)運輸及免疫活性細胞遷移、具有網(wǎng)格結(jié)構(gòu)的凝膠材料結(jié)合構(gòu)建類淋巴組織卻在國際上沒有報道，本實驗室前期研究證實透明質(zhì)酸鈉與免疫活性細胞結(jié)合能夠最大限度保持其活性并發(fā)揮最大殺傷能力。故本實驗擬應用CTL

4、細胞結(jié)合透明質(zhì)酸鈉凝膠構(gòu)建工程化類淋巴組織，以觀察其預防裸鼠直腸癌術(shù)后復發(fā)轉(zhuǎn)移的療效。
　　研究目的:建立裸鼠直腸癌局部切除模型，通過制備CTL透明質(zhì)酸鈉凝膠構(gòu)建的工程化類淋巴組織，對CTL凝膠預防裸鼠直腸癌切除后復發(fā)情況進行分析，為CTL凝膠的臨床應用奠定基礎(chǔ)。
　　研究方法:
　　1、利用人結(jié)腸癌sw480細胞系建立裸鼠低位直腸癌模型，一周后利用外科能量平臺進行切除，構(gòu)建裸鼠低位直腸癌切除模型;
　　2、提取

5、健康人血液，密度梯度離心分離PBMCs，制備載荷sw480抗原的DC細胞及T細胞，兩周后收獲CTL細胞;
　　3、稀釋透明質(zhì)酸鈉凝膠，取CTL細胞1.8×108，制備CTL凝膠待局部注射，將另一部分CTL細胞與無血清培養(yǎng)基混合，使細胞數(shù)達到6×107待尾靜脈注射;
　　4、實驗組手術(shù)部位周圍局部注射CTL凝膠，其中一組注射凝膠同時尾靜脈注射CTL溶液;
　　5、觀察腫瘤復發(fā)轉(zhuǎn)移情況，每日記錄腫瘤生長變化情況，兩周后處死

6、全部裸鼠，術(shù)區(qū)拍照對比，腫瘤、肝、脾、腫大淋巴結(jié)稱重，血液行血常規(guī)檢查，血液及研磨后脾臟行流式細胞儀檢測，腫瘤及周圍組織標本送病理檢查、免疫組化檢查;
　　6、統(tǒng)計分析效果評價。
　　研究結(jié)果:
　　1、成功構(gòu)建出裸鼠低位直腸癌模型及裸鼠低位直腸癌切除模型;
　　2、手術(shù)切除+CTL凝膠+尾靜脈注射組抑瘤率為89.45％，手術(shù)切除+CTL凝膠組82.21％，與其他三組比較差異顯著;
　　3、手術(shù)切除+CTL

7、凝膠+尾靜脈注射組腫瘤重量與手術(shù)切除+CTL凝膠組比較有差異，與手術(shù)切除組、凝膠組及對照組相比差異顯著;
　　4、手術(shù)切除+CTL凝膠+尾靜脈注射組淋巴細胞比例、血液中T細胞比例、脾指數(shù)均與其他三組差異顯著;
　　5、手術(shù)切除+CTL凝膠+尾靜脈注射組及手術(shù)切除+CTL凝膠組復發(fā)率、轉(zhuǎn)移率與手術(shù)切除組、凝膠組及對照組相比差異顯著;
　　6、病理結(jié)果提示手術(shù)切除+CTL凝膠+尾靜脈注射組及手術(shù)切除+CTL凝膠組腫瘤切除原

8、位無復發(fā)，無腫瘤組織殘留，免疫組化檢查顯示其腫瘤切除部位周圍有大量T細胞浸潤，單純凝膠組腫瘤周圍大量T細胞浸潤。
　　研究結(jié)論:
　　1、本研究制備的裸鼠直腸癌模型及裸鼠直腸癌局部切除模型符合直腸癌病理特點，制瘤率高，模擬了手術(shù)切除的過程及術(shù)后病理生理學特點，具備了直腸癌局部切除的特征，具有操作性強、方法簡便、可控性高的特點，對研究直腸癌手術(shù)及輔助治療具有較高的應用價值;
　　2、CTL凝膠能夠有效抑制裸鼠直腸癌切除術(shù)