糖基轉(zhuǎn)移酶β3Gn-T8與轉(zhuǎn)錄因子c-Jun的相關(guān)性及其與胃癌侵襲的關(guān)系.pdf

1、目的:
　　 根據(jù)已有文獻(xiàn)報(bào)道:當(dāng)細(xì)胞癌變時(shí)，細(xì)胞糖復(fù)合物上的糖鏈結(jié)構(gòu)常發(fā)生變化，而這種變化來(lái)源于合成該糖鏈的相應(yīng)糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的改變。β1，3-N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(β3Gn-Ts)家族是糖基轉(zhuǎn)移酶的重要成員，β3Gn-Ts家族參與合成其產(chǎn)物中的β1，3-乙酰氨基葡萄糖連接鍵，其成員β3Gn-T8參與合成糖蛋白上N-連接型糖鏈中的多聚乳糖胺結(jié)構(gòu)。本課題組先前研究證明，β3Gn-T8與胃癌的增殖侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可能通過(guò)對(duì)基

2、質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2表達(dá)的調(diào)控促進(jìn)胃癌的侵襲作用，因此，對(duì)MMP-2表達(dá)的調(diào)控通路有望作為控制胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的新靶點(diǎn)。本研究分析β3Gn-T8上游調(diào)控序列啟動(dòng)子區(qū)，發(fā)現(xiàn)β3Gn-T8啟動(dòng)子有五個(gè)c-Jun和一個(gè)Ets-1和結(jié)合位點(diǎn)。為了進(jìn)一步闡明β3 Gn-T8與胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，本研究以體外培養(yǎng)的人胃癌SGC7901細(xì)胞株為研究對(duì)象，探討胃癌SGC7901細(xì)胞株中轉(zhuǎn)錄因子c-Jun對(duì)糖基轉(zhuǎn)移酶β3Gn-T8的轉(zhuǎn)錄調(diào)控;c-Jun

3、基因沉默后對(duì)β3Gn-T8的表達(dá)以及對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。同時(shí)在由10例臨床標(biāo)本制作成的組織芯片上檢測(cè)c-Jun、CD147和多聚乳糖胺糖鏈的表達(dá)，對(duì)在臨床胃癌標(biāo)本中c-Jun、β3Gn-T8、多聚乳糖胺糖鏈和CD147的表達(dá)相關(guān)性進(jìn)行探討，以期為胃癌的治療提供新的途徑。
　　 方法:
　　 1.RT-PCR檢測(cè)c-Jun和β3Gn-T8在SGC7901等六種腫瘤細(xì)胞株中的表達(dá)情況。
　　 2

4、.采用c-Jun中等量表達(dá)和β3Gn-T8高表達(dá)的人胃癌SGC7901細(xì)胞株為研究對(duì)象。應(yīng)用三種生物信息學(xué)軟件對(duì)β3Gn-T8啟動(dòng)子區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子c-Jun基因的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果構(gòu)建β3Gn-T8啟動(dòng)子區(qū)系列截短體，并構(gòu)建c-Jun基因的正義表達(dá)載體，經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒的序列;應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)分析β3Gn-T8啟動(dòng)子區(qū)系列截短體的轉(zhuǎn)錄激活活性;并進(jìn)一步采用染色質(zhì)免疫沉淀( ChIP)檢測(cè)分析c-Jun蛋白與β

5、3Gn-T8基因DNA的結(jié)合。
　　 3.設(shè)計(jì)并構(gòu)建4條針對(duì)c-Jun mRNA靶點(diǎn)的siRNA真核表達(dá)質(zhì)粒載體pGPU6/GFP/Neo-shRNA，同時(shí)設(shè)計(jì)shRNA-無(wú)關(guān)序列作為陰性對(duì)照(negative control，NC)，并構(gòu)建表達(dá)載體;培養(yǎng)SGC7901細(xì)胞，以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察以最高轉(zhuǎn)染效率和最低細(xì)胞死亡率為原則，優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，根據(jù)優(yōu)化的條件將pGPU6/GFP/Neo-shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胃癌SG

6、C7901細(xì)胞，應(yīng)用RT-PCR和western blot方法在mRNA水平和蛋白水平上檢測(cè)四組pGPU6/GFP/Neo-shRNA對(duì)c-Jun基因表達(dá)的抑制作用，篩選出干擾效果最好的一組表達(dá)載體用于后續(xù)實(shí)驗(yàn);設(shè)計(jì)空白對(duì)照組(Blank組，SGC7901細(xì)胞株)、陰性對(duì)照組(NC組，pGPU6/GFP/NC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的SGC7901細(xì)胞)、c-Jun-shRNA組(pGPU6/GFP/c-Jun-shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的SGC7901細(xì)胞)

7、為研究對(duì)象，經(jīng)G418篩選，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá)載體pGPU6/GFP/c-Jun-shRNA的SGC7901細(xì)胞;應(yīng)用RT-PCR和western blot方法在mRNA水平和蛋白水平上檢測(cè)c-Jun基因沉默后β3Gn-T8的表達(dá);應(yīng)用CCK-8試劑盒檢測(cè)三組細(xì)胞的增殖能力;應(yīng)用凝集素細(xì)胞免疫熒光和FITC標(biāo)志的凝集素流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)三組細(xì)胞多聚乳糖胺糖鏈的表達(dá)。
　　 4.通過(guò)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)c-Jun、CD147和多聚乳糖胺

8、糖鏈在由10例人胃癌組織和10例癌旁非腫瘤胃組織制作而成的組織芯片上的表達(dá)，以對(duì)在臨床胃癌標(biāo)本中c-Jun、β3Gn-T8、多聚乳糖胺糖鏈及與CD147和MMP-2表達(dá)相關(guān)性進(jìn)行探討。
　　 結(jié)果:
　　 1.C-Jun和β3Gn-T8在腫瘤細(xì)胞株中的表達(dá):我們檢測(cè)了胃癌細(xì)胞株SGC7901及AGS、惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87及LN229、乳腺癌細(xì)胞株MCF-7及MDA-MB-231中均有不同程度的表達(dá)，其中，胃癌SGC7

9、901細(xì)胞株中c-Jun呈中等表達(dá)水平，β3Gn-T8呈高表達(dá)。
　　 2.生物信息學(xué)分析:AliBaba2.1、PATCH和TESS三種在線軟件預(yù)測(cè)結(jié)果分析β3Gn-T8啟動(dòng)子區(qū)存在著c-Jun基因的多個(gè)結(jié)合位點(diǎn);雙熒光素酶報(bào)告基因顯示c-Jun對(duì)β3Gn-T8啟動(dòng)子區(qū)具有轉(zhuǎn)錄激活作用，其中啟動(dòng)子區(qū)-561/+8片段的轉(zhuǎn)錄活性最高，且對(duì)c-Jun呈劑量依賴性;ChIP檢測(cè)發(fā)現(xiàn):活化的c-Jun蛋白與β3Gn-T8基因的DNA片

10、段有相互結(jié)合。
　　 3.shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建及其對(duì)胃癌生物學(xué)行為的影響:靶向c-Jun mRNA的四個(gè)pGPU6/GFP/Neo-shRNA重組質(zhì)粒表達(dá)載體經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定，證實(shí)載體構(gòu)建成功;重組質(zhì)粒表達(dá)載體通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染人胃癌SGC7901細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光，RT-PCR和 western blot結(jié)果證實(shí)pGPU6/GFP/Neo-shRNA-1949對(duì)c-Jun表達(dá)抑制的效果最好，因此，選擇該sh

11、RNA載體，構(gòu)建后續(xù)對(duì)c-Jun穩(wěn)定下調(diào)的穩(wěn)定細(xì)胞株;RT-PCR和western blot方法檢測(cè)鑒定c-Jun基因沉默后SGC7901細(xì)胞株中β3Gn-T8基因在mRNA水平和蛋白水平表達(dá)均下降;CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示c-Jun基因沉默后SGC7901細(xì)胞增殖能力明顯下降;凝集素細(xì)胞免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示c-Jun基因沉默后β3Gn-T8表達(dá)下降導(dǎo)致細(xì)胞上多聚乳糖胺糖鏈的表達(dá)量降低。
　　 4.C-Jun、CD14

12、7和多聚乳糖胺鏈在胃癌組織的表達(dá):結(jié)果顯示c-Jun在胃癌組織的表達(dá)顯著高于癌旁非腫瘤胃組織;CD147在胃癌組織高表達(dá)，而在癌旁非腫瘤胃組織幾乎無(wú)表達(dá);凝集素結(jié)合的多聚乳糖胺糖鏈表達(dá)在胃癌細(xì)胞和胃粘膜上皮細(xì)胞的胞漿中，棕黃色顆粒狀。在彌漫型胃癌中的表達(dá)呈深棕色，而在腸型胃癌的表達(dá)為淺棕色，在某些腸型胃癌的癌細(xì)胞腺腔側(cè)的胞漿及胞膜中呈深棕色顆粒狀強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。在腸型胃癌的腺腔中和印戒細(xì)胞癌的粘液池中有強(qiáng)陽(yáng)性顆粒。而在癌旁非腫瘤胃組織上皮細(xì)

13、胞中的著色強(qiáng)度及范圍明顯弱于胃癌細(xì)胞。此外，在低分化腺癌中表達(dá)較高，而在高分化腺癌中表達(dá)較低。
　　 結(jié)論:
　　 1.C-Jun和β3Gn-T8在六種腫瘤細(xì)胞株中均有表達(dá)，胃癌SGC7901細(xì)胞株中c-Jun呈中等表達(dá)量，β3Gn-T8呈高表達(dá);
　　 2.生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示β3Gn-T8啟動(dòng)子區(qū)存在著轉(zhuǎn)錄因子c-Jun的多個(gè)結(jié)合位點(diǎn);雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示c-Jun對(duì)β3Gn-T8啟動(dòng)子區(qū)具有轉(zhuǎn)錄

14、激活作用，啟動(dòng)子區(qū)-561/+8片段的轉(zhuǎn)錄活性最高，且對(duì)c-Jun呈劑量依賴性;ChIP結(jié)果顯示c-Jun蛋白結(jié)合至β3Gn-T8基因的DNA片段。因此，c-Jun參與了胃癌SGC7901細(xì)胞株中β3Gn-T8基因的表達(dá)調(diào)控，至少是調(diào)控因素之一。且呈正性調(diào)控作用。
　　 3.針對(duì)c-Jun基因的pGPU6/GFP/Neo-c-Jun-shRNA表達(dá)載體構(gòu)建成功，經(jīng)過(guò)檢驗(yàn)，pGPU6/GFP/Neo-shRNA-1949對(duì)SGC7

15、901細(xì)胞中c-Jun抑制效果最明顯;并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SGC7901細(xì)胞株，獲得c-Jun穩(wěn)定下調(diào)的SGC7901細(xì)胞株，下調(diào)c-Jun基因表達(dá)后可降低胃癌SGC7901細(xì)胞株中β3Gn-T8基因在mRNA水平和蛋白水平上的表達(dá);進(jìn)而抑制胃癌SGC7901細(xì)胞的增殖能力以及細(xì)胞多聚乳糖胺糖鏈的合成。
　　 4.C-Jun、CD147及多聚乳糖胺糖鏈結(jié)構(gòu)在人胃癌組織的表達(dá)較癌旁非腫瘤胃組織顯著增加。在彌漫型胃癌中多聚乳糖胺糖鏈結(jié)構(gòu)的表達(dá)

16、要強(qiáng)于腸型胃癌。
　　 綜上所述，轉(zhuǎn)錄因子c-Jun對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞株中糖基轉(zhuǎn)移酶β3Gn-T8的啟動(dòng)子區(qū)有轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，且呈正性調(diào)控作用;c-Jun基因沉默后能夠抑制胃癌SGC7901細(xì)胞株中糖基轉(zhuǎn)移酶β3Gn-T8的表達(dá)，抑制胃癌細(xì)胞的增值能力，并且降低胃癌細(xì)胞上多聚乳糖胺糖鏈的合成，從而抑制胃癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力;在10例胃癌病例的癌組織標(biāo)本中，c-Jun、CD147及多聚乳糖胺糖鏈結(jié)構(gòu)均明顯高表達(dá)，其趨勢(shì)與胃癌細(xì)