一個新的煙草糖基轉(zhuǎn)移酶的過表達及相關(guān)研究.pdf

1、糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyltransferase, GT)廣泛存在于原核生物、真核生物、古細菌以及病毒中，能催化糖基從激活的供體轉(zhuǎn)移到特定的受體分子上。GT在調(diào)節(jié)植物激素水平、抵御外來有害生物侵害或化合物毒害以及調(diào)節(jié)體內(nèi)化合物代謝等方面有重要作用。根據(jù)GT氨基酸序列的相似度及其催化機制的差異，可將現(xiàn)已知的GT劃分為91個家族。由于GT對于植物生命活動的重要性及其潛在的經(jīng)濟價值，已受到人們的廣泛關(guān)注。
　　 本實驗室以煙草為材料

2、，克隆了一個受水楊酸(SA)和甲基茉莉酸(MJA)誘導(dǎo)表達的新的GT基因。本研究在此工作的基礎(chǔ)上，進一步研究了該基因超表達對煙草植株表型的影響，該基因與GFP基因的融合基因在轉(zhuǎn)化植株中的表達與亞細胞定位，以及該基因在E. Coli中的表達和產(chǎn)物初步鑒定。取得了如下研究結(jié)果。
　　 以克隆的新的GT基因所編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列，在NCBI和Prosite數(shù)據(jù)庫中進行保守結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果顯示這個酶具有糖基轉(zhuǎn)移酶28家族的保守域和UD

3、P-GT的保守域。經(jīng)TMPred進行跨膜域分析表明，在該酶蛋白的N端第100-150氨基酸處具有跨膜域；利用CAZy數(shù)據(jù)庫中的GT序列與此GT序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，在與GT28家族的其它植物GT以及與煙草中其它GT比較后顯示，這個糖基轉(zhuǎn)移酶單獨構(gòu)成了一簇。
　　 以植物表達載體pCAMBIA1305.1構(gòu)建了受CaMV 35S啟動子驅(qū)動的GT基因的超表達載體。將重組載體轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌菌株EHA105后，通過葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化煙草，獲得了

4、一定數(shù)量的轉(zhuǎn)化苗。T0代植株經(jīng)特異性引物的PCR檢測，篩選到了一批陽性轉(zhuǎn)化植株，陽性檢出率為40％。經(jīng)RT-PCR檢測，GT基因在多數(shù)陽性植株中表達。利用熒光定量PCR檢測進一步檢測轉(zhuǎn)化植株，篩選到的超表達GT基因植株中，目的基因的表達量較對照提高5-23倍不等。在超表達GT基因的轉(zhuǎn)化植株中，在苗期有不同程度表型變異，其中一株表現(xiàn)出了矮化的性狀，且葉片脈絡(luò)走向、葉表觸摸手感均與正常植株明顯不同。熒光定量分析顯示此GT的表達量是對照的8倍

5、左右。TAIL-PCR擴增獲得了T-DNA插入位點的側(cè)翼序列，經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫分析并未發(fā)現(xiàn)GT基因插入位點側(cè)翼具有已知的基因序列。
　　 以植物表達載體pCANMBIA構(gòu)建了受CaMV 35S啟動子驅(qū)動的GT基因與綠色熒光蛋白(GFP)基因的融合蛋白表達載體。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)，葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化煙草，得到了一定數(shù)量的轉(zhuǎn)化苗。經(jīng)PCR檢測得到的陽性轉(zhuǎn)化植株，對其中部分陽性植株中融合基因的轉(zhuǎn)錄進行了RT-PCR分析。對鑒定的陽性植株進行根

6、尖切片，并經(jīng)質(zhì)壁分離后觀察到，含GFP的融合蛋白主要定位于根尖細胞的質(zhì)膜上。
　　 通過PCR擴增得到GT基因的ORF序列，與原核表達載體pTYB1連接，構(gòu)建了重組載體pT。經(jīng)轉(zhuǎn)化得到的含pT的大腸桿菌菌株ER2566重組子，進行IPTG誘導(dǎo)表達。表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析表明，GT基因在重組子中表達的蛋白分子量大小與預(yù)期相符。根據(jù)GT基因表達產(chǎn)物只在被檢測的各分離組分的沉淀組分中出現(xiàn)，暗示GT蛋白在重組子中以包涵體形式存在