微粒給藥系統(tǒng)的理化性質(zhì)與靶向性研究.pdf

1、本論文在研究硬脂酸固體脂質(zhì)納米粒給藥系統(tǒng)基礎(chǔ)上，以多糖的細(xì)胞核趨向性理論為核心，設(shè)計(jì)以硬脂酸化學(xué)嫁接低分子量殼聚糖(殼寡糖)，制備具有糖脂類化學(xué)結(jié)構(gòu)的新型納米載體材料—?dú)す烟?硬脂酸嫁接物。具有兩親性結(jié)構(gòu)的糖脂材料，可在水性介質(zhì)中自聚集形成嫁接物膠團(tuán)。嫁接物膠團(tuán)的陽離子特性，適用于包封蛋白類藥物的控制釋放研究。嫁接物膠團(tuán)內(nèi)核的疏水特性，可包封親脂性的抗腫瘤藥物，通過嫁接物膠團(tuán)的表面修飾，實(shí)現(xiàn)藥物的控制釋放。以嫁接物膠團(tuán)的亞細(xì)胞器趨向性理

2、論研究為基礎(chǔ)，指導(dǎo)嫁接物載藥膠團(tuán)的抗腫瘤活性研究，探索逆轉(zhuǎn)耐藥腫瘤細(xì)胞耐藥性的可能性。 以丙酸倍氯米松為模型藥物，硬脂酸為固體脂質(zhì)材料，油酸為液體脂質(zhì)材料，溶劑擴(kuò)散法制備丙酸倍氯米松硬脂酸固體脂質(zhì)納米粒和納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體?？疾煲后w脂質(zhì)的含量對(duì)納米粒粒徑、表面電位、形態(tài)、表面性質(zhì)、晶型結(jié)構(gòu)以及載藥、釋藥性能的影響。當(dāng)油酸含量低于15％時(shí)，納米粒粒徑較大，形態(tài)較為不規(guī)則；當(dāng)油酸含量達(dá)到30％時(shí)，粒徑顯著減小，為較為均一的圓球型。增加

3、納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體中油酸比例，有助于提高藥物的承載量和包封率，該結(jié)果與納米粒骨架中無定型等不規(guī)則晶型比例的增加有關(guān)。以溶劑擴(kuò)散法70℃制備得到的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體，為一種液體脂質(zhì)較多分布于納米粒表層及淺表層骨架部位的核一殼結(jié)構(gòu)，藥物體外釋放呈兩相模式，包括初始的藥物快速釋放和后期的藥物緩慢釋放的雙重功能，藥物釋放的初期和后期均符合Higuchi方程。 以碳二亞胺為交聯(lián)偶合劑制備殼寡糖．硬脂酸嫁接物。核磁共振光譜法確證嫁接物化學(xué)結(jié)構(gòu)；

4、三硝基苯磺酸法測(cè)定嫁接物氨基取代度，芘熒光法測(cè)定嫁接物在水中的臨界聚集濃度。以微粒粒度及表面電位分析儀分別測(cè)定嫁接物膠團(tuán)粒徑與表面電位，原子力顯微鏡測(cè)定嫁接物膠團(tuán)空間結(jié)構(gòu)。氨基取代度15.4％的嫁接物，在水中的臨界聚集濃度為0.035 mg.mL-1。制備得到的嫁接物膠團(tuán)，其粒徑為70.6 am，電位為46.4±0.1 mV。用原子力顯微鏡觀察，該膠團(tuán)呈球形，大小均勻。 利用殼寡糖一硬脂酸嫁接物的陽離子特性，以小牛血清白蛋白為模

5、型藥物，通過嫁接物與蛋白藥物之間的離子相互作用，制備殼寡糖．硬脂酸嫁接物膠團(tuán)/蛋白復(fù)合納米粒。用透射電鏡表征納米粒形態(tài)，以微粒粒度與表面電位測(cè)定儀測(cè)定嫁接物膠團(tuán)/蛋白復(fù)合納米粒的粒徑和表面電位。所形成的嫁接物膠團(tuán)/蛋白復(fù)合納米粒，粒徑均大于100 nm，為多個(gè)嫁接物膠團(tuán)與蛋白藥物密接后的復(fù)合結(jié)構(gòu)。嫁接物膠團(tuán)/蛋白復(fù)合納米粒粒徑，隨著分散介質(zhì)pH值的下降而減小，而表面電位與包封率隨分散介質(zhì)pH值的下降而增加。載藥納米粒的體外釋放特性符合H

6、iguchi線性方程，隨著釋放介質(zhì)pH值的下降，嫁接物的質(zhì)子化程度增強(qiáng)，藥物與嫁接物的結(jié)合能力增強(qiáng)，從而導(dǎo)致藥物從復(fù)合納米粒中的釋放速率減緩。體外穩(wěn)定性研究表明，該復(fù)合物納米粒常溫下放置具有良好的穩(wěn)定性。以戊二醛為交聯(lián)固化劑，進(jìn)行殼寡糖．硬脂酸嫁接物膠團(tuán)表面修飾，考察戊二醛濃度對(duì)固化納米粒粒徑和表面電位的影響。分別以喜樹堿和阿霉素為模型藥物，透析法制備嫁接物載藥膠團(tuán)。以微粒粒度與表面電位儀，測(cè)定嫁接物膠團(tuán)載藥前后及固化前后的粒徑和表面電

7、位。用超濾離心法分離，高效液相色譜法或熒光分光光度法測(cè)定載藥膠團(tuán)的藥物包封率，進(jìn)行藥物體外釋放研究。嫁接物載藥膠團(tuán)，經(jīng)戊二醛表面固化修飾，可減小微粒粒徑，增加藥物包封率，延緩藥物的釋放速度。隨著嫁接物氨基取代度的增加，藥物的包封率呈同步增加趨勢(shì)，藥物的釋放速率總體上出現(xiàn)減緩趨勢(shì)。選擇合適的嫁接物氨基取代度和表面固化修飾條件，可實(shí)現(xiàn)藥物的控制釋放。 以異硫氰基熒光素標(biāo)記嫁接物膠團(tuán)載體，以殼寡糖納米粒和硬脂酸納米粒為對(duì)照，考察載體的

8、理化性質(zhì)、細(xì)胞攝取和細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)性能。研究發(fā)現(xiàn)殼寡糖納米粒的細(xì)胞攝取能力最弱，硬脂酸納米粒不具備細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)能力，而嫁接物膠團(tuán)與細(xì)胞孵育2h后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)可以觀察到很強(qiáng)的熒光。其中又以細(xì)胞核熒光強(qiáng)度最高，且具有能量和濃度依賴性。膜通透后細(xì)胞與嫁接物膠團(tuán)在37℃共同孵育后，熒光標(biāo)記膠團(tuán)主要聚集細(xì)胞核。經(jīng)核定位信號(hào)肽入核途徑抑制劑Ⅳ-乙基順丁稀二酰亞胺處理，共孵育后的嫁接物膠團(tuán)仍然能夠進(jìn)入細(xì)胞核，證實(shí)嫁接物膠團(tuán)入核不是核定位信號(hào)肽入核途徑。經(jīng)糖

9、蛋白入核途徑抑制劑小麥胚芽凝集素處理，共孵育后的嫁接物膠團(tuán)不能進(jìn)入細(xì)胞核，證實(shí)嫁接物膠團(tuán)入核是糖蛋白入核途徑。低溫4℃條件下共孵育，發(fā)現(xiàn)嫁接物膠團(tuán)不能進(jìn)入細(xì)胞核，證實(shí)嫁接物膠團(tuán)入核需要消耗能量。 采用碳二亞胺偶合法，進(jìn)一步合成殼寡糖．硬脂酸聚合物的葉酸化學(xué)修飾聚合物。以抗腫瘤藥物絲裂霉素c(mitomycin，MMC)為模型藥物，考察殼寡糖-硬脂酸嫁接物載藥膠團(tuán)的理化性質(zhì)。以人II型肺癌細(xì)胞A549為模型細(xì)胞，MTT法測(cè)定載藥膠

10、團(tuán)的細(xì)胞毒性，評(píng)價(jià)嫁接物膠團(tuán)載體濃度和孵育時(shí)間對(duì)藥物抗腫瘤藥效的影響。發(fā)現(xiàn)該聚合物膠團(tuán)可以介導(dǎo)藥物進(jìn)入細(xì)胞，顯著增強(qiáng)藥物的抗腫瘤活性。經(jīng)葉酸修飾的聚合物膠團(tuán)，可增加藥物包封率，提高藥物的抗腫瘤活性。以抗腫瘤藥物阿霉素(adriamycin，Adr)為模型藥物，考察殼寡糖-硬脂酸嫁接物載藥膠團(tuán)的理化性質(zhì)。嫁接物膠團(tuán)的藥物包封率在50％以上，12h內(nèi)釋藥基本完全。MTT法測(cè)定阿霉素對(duì)耐阿霉素乳腺癌細(xì)胞MCF-7/Adr及其敏感乳腺癌細(xì)胞MC