SAPAP3基因敲除小鼠中的皮層—紋狀體突觸功能缺陷和類OCD行為.pdf

1、了解突觸行使生理功能的分子機制對于闡明神經系統(tǒng)中神經元如何進行相互的信息交流具有重要意義。目前對于突觸后分子的裝配以及功能的了解仍不深入。人們已知突觸后組織大約由數(shù)百個蛋白質組成，但對這些蛋白的生理功能仍所知甚少。目前僅初步了解了其中的極少數(shù)蛋白的生理功能。目前比較流行的突觸發(fā)育的模式是一群主要的支架蛋白通過提供多個錨定位點和與肌動蛋白細胞骨架連接位點，將大分子復合物裝配在突觸后膜。本文的目的是研究作為關鍵的突觸后蛋白之一，SAPAP(

2、SAP90／PSD95 associated protein)蛋白家族在體內的生理功能，以此作為進一步深入研究突觸后蛋白分子裝配及功能的基礎。我們綜合應用了遺傳學，生物化學，電生理學以及行為學的研究方法來闡明SAPAP3蛋白在突觸發(fā)育和功能中的作用，并研究了SAPAP3蛋白與類強迫性神經癥(Obsessive-compulsive disorder，OCD)行為的關系。 為了研究SAPAP蛋白家族的體內生理功能，我們首先制備了S

3、APAP3基因敲除小鼠(SAPAP3 knock out小鼠，以下均稱為SAPAP3突變小鼠)。并用尾巴PCR和Southern印跡和Western印跡法進行了驗證。SAPAP3突變小鼠總體上是正常的并能正常生育，但是在達到4—8月的年齡的時候，這些基因敲除小鼠100％表現(xiàn)出臉部和頸部等部位損傷的情況。這些損傷是這些基因敲除小鼠的自我損傷，這提示這些小鼠可能具有某些行為上的病理性缺陷。通過對24小時錄像解碼的分析發(fā)現(xiàn)，SAPAP3突變小

4、鼠與野生型小鼠相比，梳理行為的次數(shù)和時間顯著增加。重要的是，SAPAP3突變小鼠在發(fā)生臉、頸等部位損傷前和發(fā)生損傷后具有相同程度的梳理行為。這些數(shù)據(jù)證明SAPAP3突變小鼠有病理意義的梳理行為。為了研究是否這些SAPAP3突變小鼠有增高的焦慮水平，我們做了開放場試驗(open field test)， O型迷宮試驗(elevated zero maze test)，和暗／亮箱試驗(dark to light emergence test

5、)。在所有這三個試驗中，SAPAP3突變小鼠都表現(xiàn)出增高的焦慮水平。 SAPAP3突變小鼠的這種過度梳理行為和增高的焦慮水平讓人聯(lián)想起人類OCD類疾病的癥狀。由于選擇性5-羥色胺重攝取抑制劑(Selective SerotoninReuptake Inhibitor(SSRI))被廣泛應用于治療OCD病人并且在50％的病人中有不同程度的療效。我們也用fluoxetine(一種SSRI)對SAPAP3突變小鼠進行了連續(xù)6天的治療，

6、我們發(fā)現(xiàn)fluoxetine處理可以有效地緩解SAPAP3突變小鼠的過度梳理行為和焦慮水平。 OCD是焦慮類型的神經癥，特點是患者具有持續(xù)性的強迫性觀念和強迫性的重復行為。以前的研究已經表明OCD的發(fā)病與皮層-紋狀體-丘腦-皮層環(huán)路的功能缺陷有關。但是OCD的具體發(fā)病機制仍是個謎?？紤]到SAPAP3是SAPAP蛋白家族中唯一在紋狀體中高表達的成員，SAPAP3突變小鼠是唯一的具有類OCD行為表型的基因敲除小鼠，這強烈提示在SAP

7、AP3突變小鼠中可能有紋狀體突觸功能的缺陷。所以我們做了紋狀體腦片的場電位記錄。我們發(fā)現(xiàn)在SAPAP3突變小鼠中總的場電位降低，但NMDA(N-methyl-D-aspartate)受體介導的場電位卻增高，這說明SAPAP3可以調節(jié)AMPA(a-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionate)和NMDA這兩種類型的谷氨酸受體的突觸活性，但調節(jié)的方向相反。我們隨后通過生物化學的方法研究了SAP

8、AP3突變小鼠的紋狀體的突觸后裝配。結果顯示SAPAP3突變小鼠的紋狀體的PSD(Post SynapticDensity)中NRl的水平明顯增高，有趣的是，我們也發(fā)現(xiàn)NR2B(非成熟型亞單位)的水平也顯著增高，而NR2A(成熟型亞單位)的水平下降。這提示在SAPAP3突變小鼠中NMDA亞單位的轉換沒有發(fā)生，或者轉換后NMDA亞單位的構成沒能得到維持。結合電生理學試驗，這些結果提示SAPAP3在皮層．紋狀體突觸的功能的成熟上起重要作用。

9、另外，通過電子顯微鏡觀察，我們發(fā)現(xiàn)SAPAP3突變小鼠的紋狀體的“致密層”與野生型小鼠的“致密層”相比厚度減少。 由于在SAPAP3突變小鼠中發(fā)現(xiàn)了皮層-紋狀體突觸功能的缺陷和結構的改變，結合以前關于紋狀體環(huán)路在OCD發(fā)病中的作用的理論，我們進一步研究了在紋狀體中選擇性表達SAPAP3是否可以糾正該小鼠的表型，以驗證是否SAPAP3的缺失是引起SAPAP3突變小鼠表型的原因。我們將表達GFP(Greenfluorescence

10、protein)-SAPAP3融合蛋白的lentivirus注射入SAPAP3突變小鼠的雙側紋狀體中。在注射后4-6月，我們分析了這些小鼠的梳理行為、臉部損傷和焦慮行為。通過連續(xù)的錄像記錄分析，我們發(fā)現(xiàn)GFP-SAPAP3在紋狀體的重新表達可以緩解SAPAP3突變小鼠的強迫性梳理行為和緩解臉部損傷，并可以減緩焦慮行為。所以，紋狀體中表達SAPAP3可以糾正SAPAP3突變小鼠的行為表型。然后我們研究了紋狀體切片中的皮層-紋狀體的場興奮性

11、突觸后電位(fieldExcitatory Post Synaptic Potentials，fEPSP)。結果發(fā)現(xiàn)，與對照組(即僅注射GFPlentivirus載體的SAPAP3突變小鼠)相比，紋狀體中GFP-SAPAP3的表達可以糾正紋狀體的fEPSP。這些結果支持了關于SAPAP3在皮層-紋狀體突觸中起作用作用的觀點，同時也提示了皮層-紋狀體環(huán)路在OCD發(fā)病中的作用，證明了SAPAP3在SAPAP3突變小鼠的類OCD行為的發(fā)病過程

12、中的決定性作用。由于我們的數(shù)據(jù)強烈提示SAPAP3介導的皮層．紋狀體-丘腦-皮層環(huán)路在OCD的發(fā)病中扮演重要的角色，我們將用BAC轉基因小鼠的方法直接驗證這個想法，在這些轉基因小鼠中，SAPAP3的表達是可以被Cre重組酶調節(jié)的。如果將時空可控表達Cre的轉基因小鼠系與Cre重組酶調控性SAPAP3表達的轉基因小鼠交配，在所得的后代中，就可實現(xiàn)SAPAP3時空可調控的表達。通過將兩側有Loxp位點的STOP盒放置于SAPAP3 cDNA

13、之前，并加上HA標記(也因而命名為HA-SAPAP3STOP)，我們首先成功地制備了這些BAC轉基因小鼠，通過將這些小鼠與全基因組表達Cre的轉基因小鼠交配后，我們用抗-HA染色和western blotting的方法發(fā)現(xiàn)HA-SAPAp3STOP在小鼠表達情況與野生型小鼠的內源的SAPAP3表達特征基本一致。所以這些HA-SAPAP3STOP將為進一步的研究提供很好的實驗工具。 綜上所述，我們的研究證明了SAPAP3在皮層-紋