C3基因敲除抑制炎癥反應(yīng)促進(jìn)小鼠脊髓損傷后再生與功能恢復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、脊髓損傷(spinalcordinjury,SCI)以其高致殘率和死亡率而倍受關(guān)注。SCI的最終神經(jīng)學(xué)損害由兩種機(jī)制引起，即原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷。前者包括機(jī)械壓迫、出血、電解質(zhì)從受損細(xì)胞中外溢等；后者包括水腫、炎癥反應(yīng)、局部缺血、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、再灌注、Ca2+溢出以及過(guò)氧化基團(tuán)異常變化等對(duì)脊髓產(chǎn)生的損害作用。近年來(lái)對(duì)SCI的研究主要集中在損傷后期組織再生方面，如神經(jīng)干細(xì)胞移植或嗅鞘細(xì)胞移植等，但收效甚微。主要原因就是忽略了繼發(fā)性

2、損傷帶來(lái)的嚴(yán)重影響，損傷早期殘存的神經(jīng)元沒(méi)有得到及時(shí)的保護(hù)，從而導(dǎo)致后期再生的先決條件欠缺。對(duì)于SCI來(lái)說(shuō)，原發(fā)性損傷是一個(gè)不可逆轉(zhuǎn)的過(guò)程，而繼發(fā)性損傷則是一個(gè)可逆且可控的過(guò)程。因此，在減低原發(fā)性損傷因素的同時(shí)，應(yīng)用多種手段，如減輕炎癥免疫反應(yīng)、阻斷神經(jīng)毒性損傷、減少凋亡發(fā)生等，盡可能把繼發(fā)性損傷的程度降到最低，已成為SCI早期治療的研究熱點(diǎn)。 在繼發(fā)性損傷早期，存在一個(gè)重要的炎癥反應(yīng)過(guò)程，它能觸發(fā)其后發(fā)生的一系列針對(duì)受損部位細(xì)

3、胞和分子水平的反應(yīng)；此外，炎癥反應(yīng)可以導(dǎo)致受損局部膠質(zhì)瘢痕的形成，從而進(jìn)一步阻礙再生。抑制炎癥反應(yīng)能夠促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centralnervoussystem，CNS)的再生與功能恢復(fù)。值得注意的是，炎癥過(guò)程引起了補(bǔ)體系統(tǒng)的激活，激活的補(bǔ)體片段又能通過(guò)多種途徑導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，對(duì)自身組織成分造成損害，加重SCI后的繼發(fā)性損傷。那么是否可以通過(guò)阻斷補(bǔ)體系統(tǒng)的激活來(lái)抑制炎癥反應(yīng)，從而減輕SCI后的繼發(fā)性損傷呢?通過(guò)何種方式才能阻斷補(bǔ)體系統(tǒng)的激

4、活呢?我們選擇敲除補(bǔ)體C3基因。因?yàn)橐阎a(bǔ)體系統(tǒng)的三條激活途徑--包括經(jīng)典途徑、凝集素途徑和旁路途徑，雖然啟動(dòng)途徑不同，但最后都匯集于一點(diǎn)，即C3轉(zhuǎn)化酶對(duì)C3的分解，并在分解之后的活化過(guò)程中產(chǎn)生許多具有炎癥介質(zhì)作用的活性片斷，如C3a、C4a和C5a等，最后進(jìn)入共同的末端通路，形成攻膜復(fù)合體(membraneattackcomplx，MAC)，并導(dǎo)致炎癥反應(yīng)?？梢?jiàn)C3在補(bǔ)體系統(tǒng)已知的三條激活途徑中處于樞紐地位，是補(bǔ)體系統(tǒng)激活的必要條件。

5、本研究的目的就是通過(guò)敲除補(bǔ)體C3基因來(lái)抑制炎癥反應(yīng)，從而減輕繼發(fā)性損傷，促進(jìn)SCI后的再生和功能恢復(fù)。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為WT組(野生型)和KO組(敲基因型)，所有實(shí)驗(yàn)均在兩組之間同時(shí)比較進(jìn)行。參照改良Allen打擊法，建立C3敲基因小鼠脊髓撞擊傷模型，撞擊位置為T12，撞擊強(qiáng)度為5g×6cm，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行Basso，BeattieandBresnahan(BBB)行為學(xué)評(píng)分，并在SCI后不同時(shí)間(1h、12h、24h)分別用TNF

6、-α抗體、星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocytes，AST)的標(biāo)記物GFAP抗體以及再生抑制相關(guān)蛋白NgR抗體和RhoA抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，用westernblot檢測(cè)SCI后1h、2h、6h、12h、24hTNF-α蛋白的表達(dá)，RT-PCR檢測(cè)SCI后24hRhoAmRNA的表達(dá)，用神經(jīng)元的標(biāo)記物NF-200抗體檢測(cè)SCI后14d和21d神經(jīng)纖維再生情況，觀察敲除補(bǔ)體C3基因?qū)CI后炎癥因子TNF-α的表達(dá)、AST的活化、神經(jīng)纖維的

7、再生以及再生抑制相關(guān)蛋白NgR、RhoA表達(dá)的影響，以此驗(yàn)證通過(guò)敲除補(bǔ)體C3基因來(lái)抑制炎癥反應(yīng)、減輕繼發(fā)性損傷從而促進(jìn)再生的可行性。為了排除實(shí)驗(yàn)動(dòng)物個(gè)體差異和在體諸多干擾因素的影響，又設(shè)計(jì)了體外實(shí)驗(yàn)。首先純化培養(yǎng)AST和神經(jīng)元，達(dá)到一定生長(zhǎng)狀態(tài)后，用無(wú)菌注射器針頭呈“＃”字形劃傷，建立離體培養(yǎng)AST和神經(jīng)元機(jī)械性損傷模型，ELISA檢測(cè)細(xì)胞損傷后不同時(shí)間(1h、2h、6h、12h、24h、48h)培養(yǎng)上清中TNF-α的分泌情況，以驗(yàn)證C

8、3基因敲除對(duì)炎癥反應(yīng)的抑制。隨后將小鼠背根神經(jīng)節(jié)(dorsalrootganglion，DRG)與機(jī)械劃傷后的AST共培養(yǎng)，分別于1d、2d、3d、4d觀察DRG神經(jīng)突起生長(zhǎng)狀況。 主要結(jié)果： 1、建立了小鼠脊髓撞擊傷模型，撞擊位置為T12，撞擊強(qiáng)度為5g×6cm，SCI后小鼠呈現(xiàn)典型的截癱癥狀； 2、SCI后，WT組和KO組24h內(nèi)病理學(xué)觀察結(jié)果相似：損傷區(qū)結(jié)構(gòu)破壞，灰質(zhì)多灶性出血，損傷中心出現(xiàn)空腔，面積隨時(shí)間

9、延長(zhǎng)逐漸增大； 3、SCI后，KO組小鼠BBB評(píng)分明顯高于WT組，21d時(shí)KO組得分為17±0.8，已接近正常小鼠，而WT組得分僅為11±0.2； 4、Westernblot和FNF-α免疫組織化學(xué)結(jié)果均表明，與WT組相比，KO組SCI后各時(shí)間點(diǎn)。TNF-α免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目與免疫反應(yīng)強(qiáng)度均比較穩(wěn)定，高于KO組假手術(shù)對(duì)照，低于WT組表達(dá)的最高峰(6h)； 5、KO組小鼠SCI后，活化AST數(shù)目和活化持續(xù)時(shí)間明顯

10、減少； 6、SCI后KO組小鼠再生神經(jīng)纖維密度和長(zhǎng)度均明顯優(yōu)于WT組： 7、SCI后，KO組再生抑制相關(guān)蛋白NgR、RhoA等的表達(dá)均有升高，但與WT組無(wú)明顯區(qū)別。而westernblot結(jié)果卻表明SCI后，雖然WT組RhoAmRNA的表達(dá)升高，但KO組卻并未升高； 8、ELISA檢測(cè)AST和神經(jīng)元機(jī)械性損傷模型上清液中TNF-α含量，發(fā)現(xiàn)機(jī)械性損傷后，無(wú)論是AST還是神經(jīng)元，WT組FNF-α的表達(dá)在1h至48h

11、均顯著增加(p＜0.05)，6h達(dá)到最高峰。而KO組TNF-α的表達(dá)量未見(jiàn)顯著升高； 9、建立了DRG與AST機(jī)械性損傷模型共培養(yǎng)體系，發(fā)現(xiàn)DRG+AST(WT，未損傷)和DRG+AST(KO，未損傷)兩組中的DRG神經(jīng)突起生長(zhǎng)狀況最好，突起長(zhǎng)，密度大。DRG+AST(WT，損傷)和DRG+AST(KO，損傷)兩組中的DRG神經(jīng)突起生長(zhǎng)都受到了抑制，前者受到的抑制作用最明顯，神經(jīng)突起長(zhǎng)度最短，密度最小：后者受到的抑制作用較小，神

12、經(jīng)突起長(zhǎng)度和密度介于DRG+AST(WT/KO，未損傷)和DRG+AST(WT，損傷)之間。 主要結(jié)論： 1.C3基因敲除能夠有效抑制小鼠SCI后炎癥因子TNF-α的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)； 2.C3基因敲除能夠減少活化AST數(shù)目和持續(xù)時(shí)間，有利于減少炎癥因子的釋放、減輕繼發(fā)性損傷、改善再生環(huán)境，促進(jìn)神經(jīng)再生和功能恢復(fù)； 3.C3基因敲除后，小鼠神經(jīng)纖維再生情況得到顯著改善，運(yùn)動(dòng)能力得到較好恢復(fù)； 4

13、.C3基因敲除能夠抑制體外培養(yǎng)的AST和神經(jīng)元分泌TNF-α，有效改善神經(jīng)突起生長(zhǎng)的微環(huán)境，促進(jìn)再生。 總之，本研究通過(guò)建立C3敲基因小鼠脊髓撞擊傷模型和DRG與AST機(jī)械性損傷模型共培養(yǎng)體系，運(yùn)用免疫組織化學(xué)法、免疫熒光雙標(biāo)、westernblot、RT-PCR、細(xì)胞培養(yǎng)以及ELISA等方法，證明敲除補(bǔ)體C3基因能夠在一定程度上抑制炎癥反應(yīng)，減輕繼發(fā)性損傷，促進(jìn)神經(jīng)再生和功能恢復(fù)。說(shuō)明通過(guò)阻斷補(bǔ)體系統(tǒng)激活來(lái)促進(jìn)SCI后的神經(jīng)再