C3基因敲除抑制炎癥反應促進小鼠脊髓損傷后再生與功能恢復的實驗研究.pdf

1、脊髓損傷(spinalcordinjury,SCI)以其高致殘率和死亡率而倍受關注。SCI的最終神經(jīng)學損害由兩種機制引起，即原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷。前者包括機械壓迫、出血、電解質從受損細胞中外溢等；后者包括水腫、炎癥反應、局部缺血、生長因子、細胞因子、再灌注、Ca2+溢出以及過氧化基團異常變化等對脊髓產生的損害作用。近年來對SCI的研究主要集中在損傷后期組織再生方面，如神經(jīng)干細胞移植或嗅鞘細胞移植等，但收效甚微。主要原因就是忽略了繼發(fā)性

2、損傷帶來的嚴重影響，損傷早期殘存的神經(jīng)元沒有得到及時的保護，從而導致后期再生的先決條件欠缺。對于SCI來說，原發(fā)性損傷是一個不可逆轉的過程，而繼發(fā)性損傷則是一個可逆且可控的過程。因此，在減低原發(fā)性損傷因素的同時，應用多種手段，如減輕炎癥免疫反應、阻斷神經(jīng)毒性損傷、減少凋亡發(fā)生等，盡可能把繼發(fā)性損傷的程度降到最低，已成為SCI早期治療的研究熱點。 在繼發(fā)性損傷早期，存在一個重要的炎癥反應過程，它能觸發(fā)其后發(fā)生的一系列針對受損部位細

3、胞和分子水平的反應；此外，炎癥反應可以導致受損局部膠質瘢痕的形成，從而進一步阻礙再生。抑制炎癥反應能夠促進中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centralnervoussystem，CNS)的再生與功能恢復。值得注意的是，炎癥過程引起了補體系統(tǒng)的激活，激活的補體片段又能通過多種途徑導致炎癥反應，對自身組織成分造成損害，加重SCI后的繼發(fā)性損傷。那么是否可以通過阻斷補體系統(tǒng)的激活來抑制炎癥反應，從而減輕SCI后的繼發(fā)性損傷呢?通過何種方式才能阻斷補體系統(tǒng)的激

4、活呢?我們選擇敲除補體C3基因。因為已知補體系統(tǒng)的三條激活途徑--包括經(jīng)典途徑、凝集素途徑和旁路途徑，雖然啟動途徑不同，但最后都匯集于一點，即C3轉化酶對C3的分解，并在分解之后的活化過程中產生許多具有炎癥介質作用的活性片斷，如C3a、C4a和C5a等，最后進入共同的末端通路，形成攻膜復合體(membraneattackcomplx，MAC)，并導致炎癥反應?？梢奀3在補體系統(tǒng)已知的三條激活途徑中處于樞紐地位，是補體系統(tǒng)激活的必要條件。

5、本研究的目的就是通過敲除補體C3基因來抑制炎癥反應，從而減輕繼發(fā)性損傷，促進SCI后的再生和功能恢復。 實驗動物分為WT組(野生型)和KO組(敲基因型)，所有實驗均在兩組之間同時比較進行。參照改良Allen打擊法，建立C3敲基因小鼠脊髓撞擊傷模型，撞擊位置為T12，撞擊強度為5g×6cm，在此基礎上進行Basso，BeattieandBresnahan(BBB)行為學評分，并在SCI后不同時間(1h、12h、24h)分別用TNF

6、-α抗體、星形膠質細胞(astrocytes，AST)的標記物GFAP抗體以及再生抑制相關蛋白NgR抗體和RhoA抗體進行免疫組織化學染色，用westernblot檢測SCI后1h、2h、6h、12h、24hTNF-α蛋白的表達，RT-PCR檢測SCI后24hRhoAmRNA的表達，用神經(jīng)元的標記物NF-200抗體檢測SCI后14d和21d神經(jīng)纖維再生情況，觀察敲除補體C3基因對SCI后炎癥因子TNF-α的表達、AST的活化、神經(jīng)纖維的

7、再生以及再生抑制相關蛋白NgR、RhoA表達的影響，以此驗證通過敲除補體C3基因來抑制炎癥反應、減輕繼發(fā)性損傷從而促進再生的可行性。為了排除實驗動物個體差異和在體諸多干擾因素的影響，又設計了體外實驗。首先純化培養(yǎng)AST和神經(jīng)元，達到一定生長狀態(tài)后，用無菌注射器針頭呈“＃”字形劃傷，建立離體培養(yǎng)AST和神經(jīng)元機械性損傷模型，ELISA檢測細胞損傷后不同時間(1h、2h、6h、12h、24h、48h)培養(yǎng)上清中TNF-α的分泌情況，以驗證C

8、3基因敲除對炎癥反應的抑制。隨后將小鼠背根神經(jīng)節(jié)(dorsalrootganglion，DRG)與機械劃傷后的AST共培養(yǎng)，分別于1d、2d、3d、4d觀察DRG神經(jīng)突起生長狀況。 主要結果： 1、建立了小鼠脊髓撞擊傷模型，撞擊位置為T12，撞擊強度為5g×6cm，SCI后小鼠呈現(xiàn)典型的截癱癥狀； 2、SCI后，WT組和KO組24h內病理學觀察結果相似：損傷區(qū)結構破壞，灰質多灶性出血，損傷中心出現(xiàn)空腔，面積隨時間

9、延長逐漸增大； 3、SCI后，KO組小鼠BBB評分明顯高于WT組，21d時KO組得分為17±0.8，已接近正常小鼠，而WT組得分僅為11±0.2； 4、Westernblot和FNF-α免疫組織化學結果均表明，與WT組相比，KO組SCI后各時間點。TNF-α免疫反應陽性細胞數(shù)目與免疫反應強度均比較穩(wěn)定，高于KO組假手術對照，低于WT組表達的最高峰(6h)； 5、KO組小鼠SCI后，活化AST數(shù)目和活化持續(xù)時間明顯

10、減少； 6、SCI后KO組小鼠再生神經(jīng)纖維密度和長度均明顯優(yōu)于WT組： 7、SCI后，KO組再生抑制相關蛋白NgR、RhoA等的表達均有升高，但與WT組無明顯區(qū)別。而westernblot結果卻表明SCI后，雖然WT組RhoAmRNA的表達升高，但KO組卻并未升高； 8、ELISA檢測AST和神經(jīng)元機械性損傷模型上清液中TNF-α含量，發(fā)現(xiàn)機械性損傷后，無論是AST還是神經(jīng)元，WT組FNF-α的表達在1h至48h

11、均顯著增加(p＜0.05)，6h達到最高峰。而KO組TNF-α的表達量未見顯著升高； 9、建立了DRG與AST機械性損傷模型共培養(yǎng)體系，發(fā)現(xiàn)DRG+AST(WT，未損傷)和DRG+AST(KO，未損傷)兩組中的DRG神經(jīng)突起生長狀況最好，突起長，密度大。DRG+AST(WT，損傷)和DRG+AST(KO，損傷)兩組中的DRG神經(jīng)突起生長都受到了抑制，前者受到的抑制作用最明顯，神經(jīng)突起長度最短，密度最小：后者受到的抑制作用較小，神

12、經(jīng)突起長度和密度介于DRG+AST(WT/KO，未損傷)和DRG+AST(WT，損傷)之間。 主要結論： 1.C3基因敲除能夠有效抑制小鼠SCI后炎癥因子TNF-α的表達，減輕炎癥反應； 2.C3基因敲除能夠減少活化AST數(shù)目和持續(xù)時間，有利于減少炎癥因子的釋放、減輕繼發(fā)性損傷、改善再生環(huán)境，促進神經(jīng)再生和功能恢復； 3.C3基因敲除后，小鼠神經(jīng)纖維再生情況得到顯著改善，運動能力得到較好恢復； 4

13、.C3基因敲除能夠抑制體外培養(yǎng)的AST和神經(jīng)元分泌TNF-α，有效改善神經(jīng)突起生長的微環(huán)境，促進再生。 總之，本研究通過建立C3敲基因小鼠脊髓撞擊傷模型和DRG與AST機械性損傷模型共培養(yǎng)體系，運用免疫組織化學法、免疫熒光雙標、westernblot、RT-PCR、細胞培養(yǎng)以及ELISA等方法，證明敲除補體C3基因能夠在一定程度上抑制炎癥反應，減輕繼發(fā)性損傷，促進神經(jīng)再生和功能恢復。說明通過阻斷補體系統(tǒng)激活來促進SCI后的神經(jīng)再