人巨細(xì)胞病毒感染ECV304細(xì)胞的病變效應(yīng)及基因組表達譜研究.pdf

1、人巨細(xì)胞病毒(humancytomegalovirus，HCMV)是人類最常見的先天性感染病毒，HCMV的人群感染率高達80％以上，是目前引起孕婦活動性感染及胎兒宮內(nèi)感染最常見的病因之一，造成出生缺陷，與弓形蟲(Toxoplasmosis)、風(fēng)疹病毒(Rubellavirus)、單純瘡疹病毒(Herpessimplexvirus)、梅毒螺旋體(Syphilis)一起，并稱為人類五大生物致畸因子。同時，HCMV也是機體免疫功能低下的人群，

2、如艾滋病患者、放射損傷個體、器官移植和惡性腫瘤等病人并發(fā)感染死亡的常見原因之一。腎、肝、心臟、肺等器官移植后HCMV感染率分別達8％、29％、25％及39％。此外，HCMV還與心血管疾病、腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。因而，開展HCMV感染的病變特征與分子致病機制的研究，對于HCMV感染的防治和人口素質(zhì)的提高都具有重要的意義。 HCMV即人類皰疹病毒5型(humanherpesvirus5，HHV-5)，屬于皰疹病毒β亞科。病毒顆粒為正二

3、十面體，核酸外殼由一個蛋白質(zhì)包膜及脂質(zhì)雙分子層組成，中間為病毒基質(zhì)，成熟的病毒顆粒大小約200nm，其核衣殼直徑大小約為100nm。內(nèi)部核酸為線性雙鏈DNA分子。HCMV基因組DNA大小為230kb，是動物DNA病毒基因組最大的一類，編碼了200多種不同的病毒蛋白，由長獨特序列(UniqueLong，UL)和短獨特序列(UniqueShort，US)及兩端的反向重復(fù)序列TRL、IRL、IRS及TRS組成，通過UL和US連接部位重復(fù)序列的

4、倒置，可形成四種同分異構(gòu)體。 表達譜芯片能同時檢測成千個基因的表達，對來源于不同的個體、組織、發(fā)育階段、分化階段、病變及刺激下的細(xì)胞內(nèi)mRNA總體表達水平進行檢測，從而對這些基因表達的個體特異性、組織特異性、發(fā)育階段特異性、分化階段特異性、病變特異性、刺激特異性進行綜合的分析和判斷，可進一步研究基因與基因間相互作用的關(guān)系，提供細(xì)胞的表達調(diào)控信息。 表達譜芯片在研究包括病毒在內(nèi)的病原與宿主細(xì)胞相互作用方面應(yīng)用十分廣泛。宿主

5、細(xì)胞病原感染表達譜變化特征反應(yīng)了病毒感染的結(jié)果，約有30種病毒和26種細(xì)菌感染25種不同類型的宿主細(xì)胞表達譜已被分析研究。以參與刺激的病原及宿主細(xì)胞的類型及作用方式歸納為8種模式：1.用野生型的病原體外直接感染宿主細(xì)胞，在多個感染階段監(jiān)測表達；2.多種病原體感染同一種宿主細(xì)胞，以尋找共同參與宿主細(xì)胞防御的基因；3.用突變株或滅活病原刺激宿主細(xì)胞；4.研究病原體的特殊蛋白成分致病性；5.同種病原感染正常及突變細(xì)胞系的對比研究；6.小分子物

6、質(zhì)參與病原-宿主反應(yīng)通路作用的研究；7.細(xì)胞體外感染病原后轉(zhuǎn)入體內(nèi)后基因的差異表達研究；8.臨床樣本與動物模型差異表達的研究。 已有研究將DNA表達譜芯片應(yīng)用于HCMV的相關(guān)研究，包括HCMV和宿主細(xì)胞的兩方面的感染表達譜研究。由于所基于的技術(shù)平臺不同，在芯片的類型，芯片的密度，探針的性質(zhì)，樣本的標(biāo)記方法等方面都有所不同，在結(jié)果上有所差異。這些研究采用自制的或傳統(tǒng)的DNA表達譜芯片，研究僅局限于HCMV基因組表達譜或宿主細(xì)胞表達

7、譜的某些方面。研究的細(xì)胞主要為人成纖維母細(xì)胞(HFF)。ECV304細(xì)胞是1990年首次報道，由一日本人的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞自發(fā)轉(zhuǎn)化為的一株永生化細(xì)胞株，曾作為血管內(nèi)皮的模型在生物學(xué)及醫(yī)學(xué)研究中廣泛應(yīng)用。本研究報道了血管內(nèi)皮樣ECV304細(xì)胞體外感染HCMV的病變效應(yīng)，并利用寡核苷酸表達譜芯片分析感染引起的宿主細(xì)胞基因組表達譜變化及其意義，旨在探索HCMV的致病相關(guān)分子機制。 本研究包括以下三個部分： 一、HCMV感染ECV

8、304血管內(nèi)皮樣細(xì)胞的病變效應(yīng)研究 用HCMVAD169感染ECV304血管內(nèi)皮樣細(xì)胞，觀察病毒的感染對細(xì)胞生物性狀的影響。以常規(guī)方法傳代培養(yǎng)細(xì)胞和接種病毒，用PCR法和間接免疫熒光法分別檢測病毒即刻早期基因(IEgene)及HCMV特異的基質(zhì)蛋白(pp65)，相差顯微鏡及電子顯微鏡觀察病毒感染后細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞內(nèi)部變化，DNAladder法、TUNEL檢測細(xì)胞凋亡，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期及凋亡峰。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ECV304

9、細(xì)胞病毒感染后2d開始出現(xiàn)變化，到感染4d變化明顯，出現(xiàn)感染細(xì)胞的胞體變圓、縮小、脫壁，胞漿內(nèi)顆粒增多，細(xì)胞邊緣模糊的特征，通過對病毒特異IEgenePCR擴增及HCMV的基質(zhì)蛋白(pp65)表達的檢測，明確了HCMV對ECV304血管內(nèi)皮樣細(xì)胞的感染；電鏡觀察結(jié)果表明，病毒感染4d后，胞漿內(nèi)明顯空泡化，細(xì)胞膜微絨毛減少，核染色質(zhì)的濃集、邊緣化，線粒體出現(xiàn)溶酶體化、空泡化和自噬現(xiàn)象，形態(tài)學(xué)呈早期凋亡特征；DNALadder電泳結(jié)果顯示感

10、染細(xì)胞DNA片段化的特征條帶；流式細(xì)胞儀檢測感染4d和6d細(xì)胞凋亡率分別為4.1％和45.7％。細(xì)胞周期分析表明，到感染4d時S期細(xì)胞的增加，感染第6d，可見S期細(xì)胞明顯減少。結(jié)果提示，HCMV感染影響并調(diào)控了細(xì)胞內(nèi)DNA合成，表現(xiàn)為細(xì)胞周期變化。本研究表明，巨細(xì)胞病毒在體外細(xì)胞培養(yǎng)中可誘導(dǎo)ECV304血管內(nèi)皮樣細(xì)胞的凋亡。 二、基因組表達譜芯片篩選HCMV感染ECV304血管內(nèi)皮樣細(xì)胞的差異表達基因 本部分研究中，用包

11、含18716個基因60mer寡核苷酸探針的表達譜芯片篩選HCMV感染ECV304血管內(nèi)皮樣細(xì)胞的差異表達基因，旨在分子水平上探討HCMV的致病機制。收集HCMV感染4d的ECV304及對照細(xì)胞，用Trizol法提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度儀檢測RNA樣本濃度和純度，并用cRNA線性擴增標(biāo)記試劑盒進行雙色熒光標(biāo)記，標(biāo)記樣本與Agilent公司G4110BHuman1A(V2)Oligo芯片雜交，利用Agilent2565BA

12、基因芯片掃描儀進行圖像掃描，以AgilentG2567AAFeatureExtraction軟件篩選差異表達基因。芯片雜交結(jié)果表明，背景均一，信號點與背景熒光信號對比顯著，芯片雜交效果好。篩選得到的差異表達基因559個，471個基因表達上調(diào)，已明確功能的334個，有88個基因表達下調(diào)，已明確功能的有69個，這些差異表達基因功能可能涉及了HCMV感染調(diào)控的生物過程及致病機制。 三、表達譜芯片結(jié)果的驗證與生物信息學(xué)分析 對基

13、因表達譜芯片結(jié)果進行熒光定量PCR法驗證，以明確芯片實驗的準(zhǔn)確可靠性，也是進一步數(shù)據(jù)挖掘和分析的前提。DNA表達譜芯片數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析有助于更完整地了解基因的功能、調(diào)控和相互作用。選取RPS24、MGC8721、SLC27A3、MST4、TRAF25個上調(diào)基因和LRRC281個下調(diào)基因，采用SYBRGreenⅠ嵌合熒光法熒光定量PCR分析，對基因芯片表達譜結(jié)果進行驗證。用Onto-Express(OE)進行GeneOntology(

14、GO)定義的細(xì)胞分子生物過程分析，AnnotationDatabase軟件對病毒感染的生物過程涉及基因進行功能注解與分析。實驗結(jié)果顯示，芯片的結(jié)果與熒光定量的測定結(jié)果的結(jié)論一致。分析結(jié)果表明，HCMV感染ECV304細(xì)胞涉及273個生物過程，其中39個生物過程具有顯著性意義，包括：細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、依賴DNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、血管形成、血管內(nèi)皮生長因子調(diào)節(jié)、生殖發(fā)育、雌激素代謝、DNA復(fù)制依賴的核糖體裝配、衰老、上皮細(xì)胞分化、物質(zhì)代謝、細(xì)胞周期調(diào)

15、節(jié)等生物過程。這些生物過程都是涉及了細(xì)胞內(nèi)重要的生命活動，其中細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的統(tǒng)計學(xué)意義最為顯著(p=0.005)，表明HCMV對宿主細(xì)胞具有較強的轉(zhuǎn)錄調(diào)控能力，導(dǎo)致了細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的明顯變化。生物信息學(xué)的分析結(jié)果提示，許多顯著性分子生物過程及其組成基因可能與HCMV感染ECV304細(xì)胞的分子機制有關(guān)。HCMV感染引起的差異表達基因還涉及多個與HCMV感染及致病機制相關(guān)的生物學(xué)過程，這些生物過程及基因包括：細(xì)胞凋亡相關(guān)基因：Gran

16、zymeB、DAPK2、TARF2、TNFSF9、TNFSF10、Bcl-2L10、TGFBRAP1；G蛋白偶聯(lián)受體信號傳導(dǎo)通路基因：RGS6、RGS2、GIT1；c-Jun氨基末端激酶及MAPK通路組成基因：CRKL、SH2D3A.、MAP2K2；細(xì)胞周期相關(guān)基因：cyclinE、E2F；腫瘤相關(guān)基因：MYCL-2。 本研究主要結(jié)論如下：HCMVAD169可致ECV304血管內(nèi)皮樣細(xì)胞病變，細(xì)胞周期發(fā)生變化，表現(xiàn)明顯凋亡特征。