中藥附子反相高效液相和RAPD指紋圖譜及質(zhì)量評(píng)價(jià)研究.pdf

1、附子為毛莨科植物烏頭(AconitumcarmichaeliiDebx.)的旁生塊根(子根)，是我國(guó)常用中藥材品種之一，附子具有強(qiáng)心、提高免疫系統(tǒng)功能、抗腫瘤、抗心血管疾病、抗炎鎮(zhèn)痛及抗衰老等藥理作用。本文研究了中藥附子中有效成分的提取，對(duì)其成分的高效液相色譜分離條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立了附子鮮品及飲片的反相高效液相色譜指紋圖譜，在鮮品指紋圖譜基礎(chǔ)上對(duì)不同產(chǎn)地的附子中有效成分含量進(jìn)行了比較，同時(shí)對(duì)附子的RAPD指紋圖譜進(jìn)行了初步研究。

2、 實(shí)驗(yàn)取得的主要研究結(jié)果如下： 1、比較了乙醚-氨水、氯仿、無(wú)水乙醇體系對(duì)附子中三種主要生物堿：烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿的提取效率，并比較了冷浸、超聲二種方式提取三種生物堿的提取效率，在此基礎(chǔ)上確定了提取方式和最佳提取時(shí)間。最終確定的提取條件為乙醚：氨水(20∶1，V/V)溶液超聲提取20min。 2、比較了甲醇-水、乙腈-水體系對(duì)附子提取液的分離效果，并采用反相高效液相色譜(RPLC)多臺(tái)階梯度優(yōu)化方法對(duì)附子提取液

3、的色譜分離條件進(jìn)行優(yōu)化。經(jīng)優(yōu)化最終確定的色譜條件對(duì)附子提取液進(jìn)行分離得到20個(gè)分離效果良好的色譜峰；用試驗(yàn)對(duì)此優(yōu)化條件的穩(wěn)定性、精密度等進(jìn)行了驗(yàn)證，試驗(yàn)結(jié)果顯示了較好的預(yù)測(cè)精度和分離度。本方法分離附子提取液的分析時(shí)間短且分離度高，顯示了臺(tái)階梯度優(yōu)化方法在確定色譜分離條件上的優(yōu)越性。 3、用一種新的多臺(tái)階梯度洗脫系統(tǒng)的RPLC法，首次建立了陜西漢中、四川江油、安縣、云南、貴州不同產(chǎn)地產(chǎn)附子藥材的由10種成分組成的色譜指紋圖譜。以烏

4、頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿為參照峰作為相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行了評(píng)估。研究了漢中四種不同種質(zhì)來(lái)源的附子指紋圖譜差異，還提出用相對(duì)含量比較法對(duì)不同來(lái)源附子中10種成分的含量進(jìn)行了質(zhì)量評(píng)價(jià)。本文所建立的附子藥材的RPLC指紋圖譜方法，從試樣提取的精密度、穩(wěn)定性、圖譜重復(fù)性等方面均符合《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)》中的有關(guān)規(guī)定。該方法具有重現(xiàn)性好，特征性強(qiáng)，方法簡(jiǎn)便、快速等特點(diǎn)，有可能成為附子藥材種屬判斷、質(zhì)量評(píng)估的標(biāo)準(zhǔn)。

5、4、在建立可靠的附子藥源植物烏頭基因組DNA提取分離和RAPD-PCR擴(kuò)增技術(shù)體系的基礎(chǔ)上篩選具有穩(wěn)定的多態(tài)性的RAPD引物。利用RAPD標(biāo)記檢測(cè)4個(gè)地方類(lèi)群的附子藥源植物的DNA遺傳多態(tài)性，構(gòu)建附子藥源植物的DNA指紋圖譜。篩選的引物擴(kuò)增條帶清晰并具有5～16個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。利用瓊脂糖凝膠電泳可以便捷地檢測(cè)擴(kuò)增的DNA多態(tài)性。從11條RAPD隨機(jī)引物中篩選出3條RAPD引物，確定了120多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，對(duì)四個(gè)類(lèi)群的附子藥源植物進(jìn)行了RA