海洋中藥干貝的高效液相色譜指紋圖譜研究

1、<p>　　海洋中藥干貝的高效液相色譜指紋圖譜研究</p><p>　　作者：程紅艷，陳軍輝，趙恒強(qiáng)，張道來(lái)，史倩，王小如</p><p>　　【摘要】 　　目的建立海洋中藥干貝高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜分析方法，為其質(zhì)量控制和藥材鑒別提供依據(jù)。方法采用反相Alltima-C18柱，水（A）和乙腈（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速為0.8 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，

2、柱溫20℃，進(jìn)樣體積30μl；采用高效液相色譜二極管陣列檢測(cè)器-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC-DAD-MS）對(duì)其特征峰進(jìn)行快速分析；采用相似度計(jì)算軟件用于10批干貝藥材的相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果初步建立了干貝藥材的HPLC指紋圖譜，10批干貝藥材指紋圖譜有9個(gè)共有峰，相似度均在0.85以上；HPLC-DAD-MS分析獲得的4個(gè)特征峰的紫外光譜和質(zhì)譜信息，可用于干貝藥材指紋圖譜特征峰以及共有峰的準(zhǔn)確確定。結(jié)論該方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好，為干貝藥材的真?zhèn)?/p>

3、鑒別及質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)。 </p><p>　　【關(guān)鍵詞】 干貝； 高效液相色譜法； 指紋圖譜</p><p>　　Abstract：ObjectiveTo establish a chromatographic fingerprint of Dried Scallop, a kind of Chinese marine medicine, by high performance

4、liquid chromatography (HPLC), and apply for quality assessment and control of medicine materials of Dried Scallop. MethodsSeparation was performed on an Alltima-C18 (250 mm × 4.6 mm, 5μm), with mobile phase consisti

5、ng of water (A) and acetonitrile (B) with gradient elution at the flow rate of 0.8 ml/min. The UV detection wavelength was 210 nm, column temperature w</p><p>　　Key words： Dried Scallop; High performance liq

6、uid chromatography; Fingerprint </p><p>　　干貝Dried Scallop為扇貝科動(dòng)物櫛孔扇貝Chlamys farreri(Jones et Preston)、華貴櫛孔扇貝Chlamys nobilis(Reeve)和花鵲櫛孔扇貝Chlamys pica(Reeve)的閉殼肌，經(jīng)煮熟、干燥后得到的干制品扇貝柱，其鮮嫩味美，是深受消費(fèi)者喜愛(ài)的重要海產(chǎn)八珍之一［1］。干貝之

7、鮮味因干制濃縮，十分峻烈，古人曾說(shuō)過(guò)“干貝峻鮮 ， 無(wú)物可與倫比，食后三日猶覺(jué)雞、蝦乏味”。這是因?yàn)樗缓０贰㈦?、谷氨酸和琥珀酸等多種呈鮮物質(zhì)所致，且含有蛋白質(zhì)、磷酸鈣、維生素A、維生素B和維生素D等多種營(yíng)養(yǎng)成分，是食補(bǔ)精華［2］?！吨腥A本草》中記載干貝具有滋陰、養(yǎng)血、補(bǔ)腎、調(diào)中的功效，具有抗腫瘤、促生長(zhǎng)等藥理作用；近年來(lái)，醫(yī)學(xué)界證明了干貝的藥用價(jià)值，能作為營(yíng)養(yǎng)不良調(diào)理、補(bǔ)血調(diào)理、滋陰調(diào)理和益智補(bǔ)腦調(diào)理等食療［3，4］。干貝作為一種重

8、要的海洋中藥（海洋保健食品）資源，對(duì)其的質(zhì)量控制國(guó)內(nèi)外至今未見(jiàn)報(bào)道。</p><p>　　近年來(lái)，由于中藥指紋圖譜技術(shù)可全面反映中藥材的藥效成分及其相對(duì)比例，能有效表征復(fù)雜中藥的質(zhì)量，已廣泛用于陸源中藥原藥材及其制品的質(zhì)量控制［5，6］，而用于海洋藥物的鑒別以及質(zhì)量控制研究還較少［7，8］。最近，本課題組已經(jīng)成功建立了羅氏海盤(pán)車、馬糞海膽和海參等海洋中藥的高效液相色譜指紋圖譜［9，10］。本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上

9、，首次對(duì)海洋中藥干貝的HPLC指紋圖譜進(jìn)行研究，為干貝的質(zhì)量控制建立了一種有效的現(xiàn)代分析方法。</p><p><b>　　1 儀器與材料</b></p><p>　　1.1 儀器1200 型高效液相色譜儀，配有四元泵，二極管陣列檢測(cè)器（DAD），自動(dòng)進(jìn)樣器等（美國(guó)Agilent公司）；6320型離子阱質(zhì)譜儀，配有電噴霧（ESI）離子源和大氣壓化學(xué)電離（APCI）

10、源（美國(guó)Agilent公司）；KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波儀（昆山市超聲儀器有限公司）；R201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司）；FA1104型電子天平（上海精天電子儀器廠）；THZ-8 恒溫水浴鍋（中國(guó)浙江嘉興電熱儀器廠）；Milli-Q(18.2 MΩ) 超純水處理系統(tǒng)(美國(guó)Millipore 公司)。</p><p>　　Alltima-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μ

11、m，美國(guó)Alltech）；Diamonsil-C18色譜柱 (4.6 mm×150 mm，5 μm，中國(guó)Dikma)；Zorbax Bonus-RP C18色譜柱(4.6 mm×250 mm， 5 μm，美國(guó)Agilent)；Sinochrom ODS-BP C18色譜柱（4.6 mm ×200 mm，5μm，中國(guó)大連依利特）；Eclipse XDB-C18 （4.6 mm×150 mm，5 μm

12、，美國(guó)Agilent公司）。</p><p>　　1.2 材料甲醇、乙腈為色譜純（德國(guó)MERCK公司）；乙酸色譜純（德國(guó)Riedel公司）；磷酸色譜純（天津瑞金特化學(xué)品有限公司）；水為自制Milli-Q超純水；乙醇為分析純（煙臺(tái)三和化學(xué)試劑有限公司）；正丁醇為分析純（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；醋酸乙酯為分析純（天津廣成化學(xué)試劑公司）；氯仿為分析純 (煙臺(tái)三和化學(xué)試劑有限公司)。</p>&l

13、t;p>　　本實(shí)驗(yàn)所采用的干貝樣品從青島、煙臺(tái)、連云港等沿海城市收集，共10批次，編號(hào)為S1-S10（見(jiàn)表 1），經(jīng)中國(guó)海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院曾曉起教授鑒定均為正品干貝Dried Scallop。表 1 干貝藥材來(lái)源（略）</p><p><b>　　2 方法</b></p><p>　　2.1 色譜分析條件Alltima-C18色譜柱（4.6 mm×

14、250 mm, 5 μm），流動(dòng)相：水（A），乙腈（B），梯度洗脫程序?yàn)門(mén)：0～15～20～50 min，流動(dòng)相比例B%：50%～87%～100%～100%，柱溫20℃，流速為0.8 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm，進(jìn)樣量：30 μl。</p><p>　　2.2 質(zhì)譜分析條件流動(dòng)相：0.2% 醋酸水溶液（A），0.2%醋酸乙腈溶液（B）；其他色譜分離條件同上，色譜柱后分流進(jìn)入質(zhì)譜的流動(dòng)相流速：0.4 m

15、l/min，電噴霧離子源，正離子電離模式，霧化氣壓力：50 psi，干燥氣（N2）流速：11.0 L/min，干燥氣體溫度：350℃，毛細(xì)管電壓：4 000 V，全掃描(Scan)質(zhì)荷比（m/z）范圍：120～1 000。</p><p>　　2.3 樣品溶液的制備將干貝樣品60 ℃烘干6 h，粉碎，過(guò)40目篩備用。準(zhǔn)確稱取1.00 g干貝粉樣品，置于100 ml具塞錐形瓶中，加入30 ml正丁醇、乙醇混合液（

16、V∶V=4∶1），在室溫條件下超聲提取30 min，靜置30 min，取上清液于100 ml旋蒸瓶中，在80 ℃ 條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，用乙腈溶解提取物并定容至5 ml，過(guò)0.45 μm微孔濾膜后作為供試品溶液。</p><p><b>　　3 結(jié)果</b></p><p>　　以干貝藥材的9個(gè)共有峰 (1～9號(hào)峰，見(jiàn)圖 1)的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積來(lái)考察儀器精

17、密度、實(shí)驗(yàn)方法的重復(fù)性及穩(wěn)定性。</p><p>　　3.1 精密度實(shí)驗(yàn)取</p><p>　　S1號(hào)樣品的供試品液，按照“2.1”項(xiàng)色譜分析條件，重復(fù)進(jìn)樣5 次測(cè)定，記錄指紋圖譜，結(jié)果表明，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積比值無(wú)明顯變化，RSD值分別為0.06% ～0.14%和1.50%～3.73%，符合指紋圖譜要求。</p><p>　　3.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

18、</p><p>　　取 S1號(hào)樣品6份，制備供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)色譜分析條件進(jìn)樣分析，記錄指紋圖譜，結(jié)果表明，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積比值無(wú)明顯變化，RSD值分別為 0.11% ～0.17%和2.79%～6.68%，符合指紋圖譜要求。</p><p>　　3.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取</p><p>　　S1號(hào)樣品的供試品液，按照“2.1”項(xiàng)色譜分析條

19、件，分別在 0，3，6，8，12，24，48 h進(jìn)樣分析，記錄指紋圖譜，結(jié)果表明，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積比值無(wú)明顯變化，RSD分別為 0.11% ～0.80%和2.10%～4.90%，顯示供試品溶液至少在 48 h穩(wěn)定，符合指紋圖譜要求。</p><p>　　3.4 樣品的指紋圖譜測(cè)定分別取不同批次的干貝樣品10個(gè)，按供試品溶液的制備方法獲得供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)色譜分析條件進(jìn)行分析，記錄各批

20、次干貝樣品的指紋圖譜（見(jiàn)圖 1），通過(guò)對(duì)不同樣品圖譜的比較，選擇穩(wěn)定性好、吸收強(qiáng)、特征明顯的色譜峰為共有峰，確定9個(gè)峰為干貝藥材指紋圖譜共有峰。其中9 號(hào)峰化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，保留時(shí)間以及峰面積重復(fù)性良好，與其它相鄰峰分離良好，采用化學(xué)工作站計(jì)算該峰的純度，表明該峰為一純化合物，因此選擇9號(hào)峰為參照峰（保留時(shí)間和峰面積均設(shè)為1），用于計(jì)算各共有峰與內(nèi)參峰的相對(duì)保留時(shí)間（見(jiàn)表 2）及相對(duì)峰面積（見(jiàn)表 3），各樣品的各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小

21、于 0.11%，更進(jìn)一步說(shuō)明本方法的可靠性。統(tǒng)計(jì)共有峰與總峰面積的百分比，結(jié)果表明，共有指紋峰的峰面積百分比大于 90%，符合指紋圖譜研究的&gt;90%的檢測(cè)要求。表2 10批干貝藥材樣品中各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間（略）表3 10批干貝藥材樣品中各共有峰的相對(duì)峰面積（略）</p><p>　　3.5 特征峰的準(zhǔn)確定位在本研究所建立的分析系統(tǒng)下，干貝提取物成分出峰時(shí)間主要在35 min之前，包含9個(gè)共

22、有峰，其中特征性最為明顯的有4 個(gè)色譜峰，這4 個(gè)色譜峰即構(gòu)成干貝HPLC指紋圖譜的特征峰（分別為峰1，2，8，9；見(jiàn)圖 1），用于干貝藥材HPLC指紋圖譜共有峰的快速準(zhǔn)確識(shí)別和定位。采用高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC-ESI-MS）對(duì)干貝指紋圖譜中的特征峰進(jìn)行分析，HPLC工作條件同“2.1”項(xiàng)色譜條件，ESI-MS按照“2.2”項(xiàng)質(zhì)譜條件進(jìn)行檢測(cè)分析，獲得的質(zhì)譜總離子流色譜圖（TIC），如圖2所示，可以看出干貝的正丁醇、

23、乙醇混合溶劑提取物中各特征峰質(zhì)譜分析信號(hào)良好，干貝指紋圖譜中的4 個(gè)特征峰的質(zhì)譜圖及DAD光譜圖（圖3）。查閱國(guó)內(nèi)外干貝化學(xué)成分研究的相關(guān)文獻(xiàn)及相關(guān)天然產(chǎn)物化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)干貝指紋圖譜中的4 個(gè)特征峰可能為沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道的新化合物；根據(jù) HPLC-ESI-MS獲得的4 個(gè)特征峰的質(zhì)譜圖及DAD光譜圖，結(jié)合4個(gè)特征峰的保留時(shí)間，可以實(shí)現(xiàn)干貝藥材指紋圖譜特征峰以及共有峰的快速準(zhǔn)確定位，對(duì)干貝HPLC指紋圖譜用于干貝藥材的真?zhèn)舞b別具有重要意

24、義。</p><p>　　3.6 相似度計(jì)算 10批干貝樣品分別購(gòu)買(mǎi)于沿黃、渤海不同城市，樣品的代表性較好。通過(guò)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng) ”(《中國(guó)藥典》2004A版 ) 對(duì)10 批干貝藥材的指紋圖譜進(jìn)行相似度分析，首先將色譜工作站數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥指紋圖譜相似度計(jì)算軟件，選定上述 9 個(gè)共有峰進(jìn)行譜峰匹配， 通過(guò)中位數(shù)矢量計(jì)算得出干貝樣品指紋圖譜的共有模式（見(jiàn)圖1），并以此共有模式為對(duì)照模版（參考指紋圖譜）

25、，用于10批干貝藥材相似度評(píng)價(jià)，相似度評(píng)價(jià)結(jié)果均大于0.85（見(jiàn)表4），說(shuō)明這10批干貝藥材的化學(xué)成分一致性較好。由相似度計(jì)算結(jié)果可以看出，S3樣品指紋圖譜與共有模式的相似度高達(dá)0.984，因此，S3樣品的指紋圖譜也可以作為干貝藥材的參考指紋圖譜（見(jiàn)圖4），具有較好的代表性和科學(xué)性，而S3樣品則可以作為干貝藥材的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用于干貝藥材的HPLC指紋圖譜質(zhì)量評(píng)價(jià)。表4 10批干貝藥材的相似度計(jì)算結(jié)果（略）</p><

26、p><b>　　4 討論</b></p><p>　　4.1 提取溶劑與提取方法的選擇本研究對(duì)5種不同提取溶劑及其混合液（甲醇、乙醇、醋酸乙酯、正丁醇、氯仿）制備干貝提取物進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，干貝不同溶劑提取物HPLC指紋特征差異顯著，乙醇、正丁醇混合液提取物HPLC指紋圖譜效果最好，且正丁醇、乙醇混合液既能提取出干貝中不同極性的小分子物質(zhì)，提取液無(wú)需經(jīng)過(guò)去除蛋白、脫鹽等過(guò)程便可

27、直接進(jìn)樣檢測(cè)，且該提取溶劑相對(duì)毒性較小、價(jià)格便宜，因此選擇正丁醇、乙醇混合液做干貝HPLC指紋圖譜制備提取溶劑；另外，還對(duì)不同比例正丁醇、乙醇混合液進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，正丁醇、乙醇體積比為4∶1的混合效果最佳。此外，還對(duì)超聲波提取法、水浴加熱法、回流提取法進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，以正丁醇、乙醇混合溶劑（V∶V=4∶1）進(jìn)行回流提取和水浴加熱提取效果不理想，原因可能是兩種溶劑混合提取時(shí)，沸點(diǎn)相差較大，低沸點(diǎn)溶劑揮發(fā)損失大，較高沸點(diǎn)溶劑則因

28、提取溫度過(guò)低無(wú)法沸騰。最終選擇超聲提取法，超聲提取過(guò)程中，溫度發(fā)生一定波動(dòng)，經(jīng)考察對(duì)實(shí)驗(yàn)基本沒(méi)有影響，故提取過(guò)程中無(wú)需嚴(yán)格控溫。在以上最佳條件下，提取一次即可獲得較為理想的提取效率，故無(wú)需多次提取。</p><p>　　4.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇通過(guò)二極管陣列檢測(cè)器全波段掃描（190～400 nm），考察了不同檢測(cè)波長(zhǎng)對(duì)指紋圖譜的影響，結(jié)果表明，在UV 210 nm條件下檢測(cè)獲得的色譜指紋圖譜信息量大，指紋峰特征性

29、強(qiáng)，具有較好的代表性，因此選擇210 nm作為干貝HPLC 指紋圖譜研究的檢測(cè)波長(zhǎng)。</p><p>　　4.3 色譜柱與流動(dòng)相的選擇干貝成分復(fù)雜含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、微量元素等營(yíng)養(yǎng)成分［3］，采用等度洗脫的方法很難將干貝提取物中的多種化合物分離開(kāi)，因此采用線性梯度洗脫方式進(jìn)行分離。本研究對(duì)“儀器”中所列的5 根不同生產(chǎn)廠家的色譜柱進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，使用Alltima-C18色譜柱獲得的干貝提取物

30、指紋圖譜各峰分離度高，色譜峰分布均勻，峰型好看，具有較好的代表性，因此選擇Alltima-C18 柱用于干貝藥材的指紋圖譜研究。在此基礎(chǔ)上，比較了甲醇、乙腈、水為流動(dòng)相時(shí)的色譜圖效果，并加入磷酸、乙酸調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH以改善分離度和色譜峰形，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以水-乙腈為流動(dòng)相時(shí)，進(jìn)行梯度洗脫50 min，可以使全部色譜峰流出，并且色譜峰的分離度較好。</p><p>　　4.4 質(zhì)譜條件的考察本研究比較了ESI-MS和AP

31、CI-MS兩種質(zhì)譜技術(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干貝的正丁醇、乙醇混合溶液提取物在APCI-MS正、負(fù)模式下均幾乎沒(méi)有響應(yīng)，而在ESI-MS正離子模式下，大部分化合物均能產(chǎn)生質(zhì)譜信號(hào)，說(shuō)明提取物中化合物的極性偏高，ESI-MS正離子模式適用于干貝化學(xué)成分的分析。</p><p>　　4.5 小結(jié)本文采用HPLC法，建立了干貝的HPLC指紋圖譜，結(jié)合相似度分析可用于干貝藥材的真?zhèn)舞b別及質(zhì)量控制。此外，應(yīng)用HPLC-ESI-MS

32、聯(lián)用技術(shù)，成功對(duì)干貝指紋圖譜的4個(gè)特征峰進(jìn)行了紫外光譜和質(zhì)譜表征，提高了HPLC指紋圖譜作為干貝藥材真?zhèn)伪鎰e與質(zhì)量控制準(zhǔn)確性和特征性，也為今后對(duì)干貝的活性化學(xué)成分的鑒別提供了方法學(xué)依據(jù)。通過(guò)HPLC指紋圖譜可以比較全面地反映干貝藥材的化學(xué)成分以及各特征性成分間峰面積的相對(duì)比例，進(jìn)而反映干貝藥材的內(nèi)在質(zhì)量,為干貝藥材判斷真?zhèn)?、評(píng)價(jià)優(yōu)劣、考察穩(wěn)定性和一致性提供依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)中所建立的測(cè)定方法快速準(zhǔn)確，靈敏度高，可作為干貝質(zhì)量控制和應(yīng)用的依據(jù)以

33、及中藥研究的方法學(xué)借鑒。</p><p><b>　　【參考文獻(xiàn)】</b></p><p>　?。?］張國(guó)琛，毛志懷，牟晨曉. 微波真空干燥扇貝柱的物理和感觀特性研究［J］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2004，20（3）：141.</p><p>　?。?］李 敏，關(guān)志強(qiáng)，孫小紅. 凍干過(guò)程扇貝貝柱物性參數(shù)的確定及實(shí)驗(yàn)研究［J］.農(nóng)機(jī)化研究，2009,4：

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