基于適體技術(shù)體外檢測血管內(nèi)皮生長因子165.pdf

1、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是體內(nèi)重要的血管生長因子,促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖和新血管的生成。VEGF165是VEGF家族中活性最強的因子,在內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)的基礎(chǔ)研究、信號途徑、臨床診斷等方面具有重要作用,因此如何對其進(jìn)行準(zhǔn)確快速的檢測已經(jīng)成為研究的重點。常用檢測蛋白方法是以抗體為工具,因其本身的缺陷,限制了其應(yīng)用。核酸適體為一段寡聚單鏈DNA或RNA分子,與抗體相比具有

2、較高的特異性和親和性,同時具有穩(wěn)定性好、制備周期短、免疫原性小、靶分子范圍廣等優(yōu)點,作為可替代抗體的適體,在科學(xué)研究、臨床診斷和治療中具有很好的前景。
　　本文首先探討了以適體替代抗體通過點雜交和Eastern blotting方法體外檢測非還原狀態(tài)和還原狀態(tài)的VEGF165。并和以抗體做的結(jié)果進(jìn)行比較。另外,本文還利用基于適體的局部保護(hù)原理(Aptamer-Based Regionally Protected PCR, ARP-

3、PCR),對VEGF165蛋白進(jìn)行檢測。適體與蛋白孵育結(jié)合后,加入DNase I將未與蛋白結(jié)合的適體酶切掉,由于蛋白的保護(hù)作用,與蛋白結(jié)合的適體區(qū)域免于酶切,免于酶切的適體被保護(hù)區(qū)域通過PCR擴增,以此檢測蛋白的存在,最后對ARP-PCR方法進(jìn)行特異性分析。
　　利用點雜交和Eastern blotting分別對非還原蛋白和還原蛋白進(jìn)行檢測,點雜交的結(jié)果顯示,設(shè)置的兩個靶蛋白樣品量(1.75μg、3.5μgVEGF165)有檢測到

4、陽性結(jié)果,說明抗體和適體的檢測底限均為1.75μg且特異性良好;Eastern blotting的結(jié)果顯示,抗體和適體的檢測底限均為14μg且特異性良好。但Eastern blotting的靈敏性不如點雜交,可能是因為電泳和轉(zhuǎn)膜操作中蛋白有一定量的損失導(dǎo)致。利用ARP-PCR方法對蛋白進(jìn)行檢測,為體現(xiàn)蛋白的保護(hù)作用,分別在加蛋白和未加蛋白的情況下做的。結(jié)果顯示未加蛋白時,酶切0.5h-2h內(nèi),適體均被酶切掉;加蛋白的情況下,酶切0.5h