重型顱腦傷腦干呼吸中樞(PreBotC)差異蛋白譜及功能研究.pdf

1、隨著現(xiàn)代交通工業(yè)和高空作業(yè)的發(fā)展，特別是具有死亡率高、致殘率高特點的重型顱腦創(chuàng)傷的發(fā)病率逐年升高。重型顱腦創(chuàng)傷具有死亡率高、致殘率高的特點，而其導(dǎo)致死亡的一個重要原因就在于腦干生命中樞受損。研究證實，腦干生命中樞存在一個產(chǎn)生和調(diào)節(jié)呼吸節(jié)律的特殊結(jié)構(gòu)——pre-Botzinger復(fù)合體(pre-Botzinger Complex，preBotC)，這為研究腦干抑制特別是呼吸功能不全提供了更加精確的“靶點”。而蛋白組學(xué)作為一種系統(tǒng)生物學(xué)方法

2、，具有全面、高通量的特點，更適合于描述顱腦創(chuàng)傷后呼吸功能變化這類復(fù)雜的機(jī)體生物變化。本實驗在制備顱腦創(chuàng)傷合并呼吸功能不全動物模型的基礎(chǔ)上，應(yīng)用蛋白組學(xué)的方法，以腦干呼吸中樞preBotC為研究對象，應(yīng)用基于液相色譜——質(zhì)譜技術(shù)的蛋白非標(biāo)記定量技術(shù)建立preBotC差異蛋白譜，并對差異蛋白進(jìn)行功能分析，進(jìn)一步探索顱腦創(chuàng)傷合并呼吸功能不全時呼吸中樞preBotC的蛋白質(zhì)變化，為進(jìn)一步治療創(chuàng)傷后呼吸功能不全提供可能的靶標(biāo)。
　　 一、

3、大鼠重型顱腦損傷合并呼吸功能不全模型的建立及腦干呼吸中樞的定位
　　 目的：研究大鼠重型顱腦損傷合并呼吸功能不全動物模型的制備方法，探討腦干呼吸中樞的定位方法，為進(jìn)一步研究重型顱腦創(chuàng)傷合并呼吸功能不全提供模型基礎(chǔ)，為腦干呼吸中樞的取材提供方法學(xué)依據(jù)。
　　 方法：利用液壓致傷裝置對雄性SD大鼠致傷，制備重型顱腦傷模型(峰壓力2.7-2.8 atm)，根據(jù)傷后2h血氣分析篩選合并呼吸功能不全組(簡稱實驗組)。通過延髓舌下神

4、經(jīng)處定位preBotC解剖平面，再通過其特異性NK1R免疫組化染色，精確定位其在舌下神經(jīng)平面的具體位置。
　　 結(jié)果：大鼠致傷后均出現(xiàn)呼吸慢、血壓低、心率慢等腦干抑制現(xiàn)象，以呼吸變化最為顯著。所有動物傷后均立即出現(xiàn)短暫呼吸暫停，持續(xù)時間由1-10分鐘不等。動物呼吸機(jī)輔助呼吸后，80.0％(36/40)大鼠能恢復(fù)自主呼吸但不規(guī)則，并最終有33只動物(82.5％)符合血氣分析標(biāo)準(zhǔn)納入重型顱腦傷合并呼吸功能不全組(簡稱‘實驗組’)。<

5、br>　　 結(jié)論：本實驗成功地建立了大鼠重型顱腦損傷合并呼吸功能不全模型，該模型穩(wěn)定性好、重復(fù)性好，呼吸變化明顯，致傷動物通過及時有效的輔助呼吸可存活2小時以上。以舌下神經(jīng)處為解剖定位標(biāo)志，成功制備了包含在舌下神經(jīng)在內(nèi)的preBotC組織切片，并以NK1R免疫組化的方法精確定位了腦干呼吸中樞preBotC。
　　 二、大鼠重型顱腦損傷preBotC的差異蛋白譜研究——“蛋白非標(biāo)記定量技術(shù)”
　　 目的：探討大鼠重型顱腦

6、損傷后preBotC差異蛋白譜的建立方法，建立大鼠重型顱腦損傷preBotC的差異蛋白譜，為大鼠重型顱腦損傷preBotC的差異蛋白譜的功能分析提供研究基礎(chǔ)。
　　 方法：提取樣品總蛋白后按Bradford法測定總蛋白濃度，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測總蛋白分布，對其進(jìn)行酶切預(yù)處理后采用基于液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)的蛋白非標(biāo)記定量技術(shù)(Label-free LC-MS)進(jìn)行分析，進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索得到重型顱腦損傷preB

7、otC差異蛋白譜，并對此譜行聚類分析。
　　 結(jié)果：大鼠重型顱腦傷腦干呼吸中樞差異蛋白譜共74種差異蛋白(差異倍數(shù)為2倍，p＜0.05)，其中表現(xiàn)為上調(diào)的差異蛋白為34種，表現(xiàn)為下調(diào)的有40種。
　　 結(jié)論：建立和完善了腦干preBotC等腦組織深部核團(tuán)的定量蛋白組學(xué)處理和檢測方法，該方法穩(wěn)定性、重現(xiàn)性好，定量精確度高，是一種較好的腦組織深部核團(tuán)定量蛋白組學(xué)檢測方法。成功建立了重型顱腦損傷腦干呼吸中樞的差異蛋白譜。

8、>　　 三、大鼠重型顱腦傷腦干呼吸中樞差異蛋白譜的功能分析
　　 目的：對大鼠重型顱腦傷腦干呼吸中樞差異蛋白譜進(jìn)行功能分析，為重型顱腦損傷的治療提供可能的新靶點。
　　 方法：采用基因本體學(xué)分析(Gene Ontology analysis)對重型顱腦傷preBotC差異蛋白譜從系統(tǒng)學(xué)高度進(jìn)行功能顯著性分析，得到差異蛋白譜對應(yīng)的的顯著性變化功能表，同時構(gòu)建顯著性變化功能間的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖(GO Map)。
　　 結(jié)

9、果：根據(jù)大鼠重型顱腦傷preBotC顯著性變化功能表和功能關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖分析表明，與preBotC74種差異蛋白相對應(yīng)的顯著性變化功能為128種，其中表現(xiàn)為功能上調(diào)的為94種，表現(xiàn)為功能下調(diào)的34種。同時表明與細(xì)胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)運，突觸小泡轉(zhuǎn)運，神經(jīng)元分化，腺嘌呤代謝，微管解聚，再生與愈合、組胺攝取與轉(zhuǎn)運，黑色素代謝，退行性蛋白轉(zhuǎn)運，對損傷刺激的反應(yīng)，能量代謝等九種病理生理變化相關(guān)。
　　 結(jié)論：大鼠重型顱腦傷腦干呼吸中樞(preBotC