液相色譜-化學發(fā)光聯(lián)用技術在中藥酚類活性成分藥動學中的應用研究.pdf

1、化學發(fā)光法（chemiluminescence，CL）是根據(jù)化學發(fā)光反應產(chǎn)生的輻射光的發(fā)光強度來確定反應中相應物質(zhì)含量的分析方法，化學發(fā)光法與高效液相色譜聯(lián)用（HPLC－CL）技術將高效分離手段與高靈敏的檢測技術相結合，因其具高選擇性、有靈敏度高、線性范圍寬等優(yōu)點而倍受青睞，已在臨床、環(huán)境、食品和藥物分析等領域得到了廣泛應用。酚類活性成分具有廣泛的生物學活性，我國傳統(tǒng)中藥（復方制劑）很多以酚類化合物作為主要成分，近年來酚類活性成分日益受

2、到關注，而目前的研究主要集中于酚類化合物的藥理作用方面，藥動學方面的研究相對較少。本研究針對中藥酚類活性成分藥動學研究中生物樣品干擾組分多、藥物含量低、濃度變化范圍大等分析技術難題，利用HPLC－CL的高選擇性、高靈敏度和寬線性范圍等優(yōu)點，建立了中藥酚類活性成分山奈酚以及丹參中六種水溶性酚類化合物的體內(nèi)分析新方法，并結合微透析采樣技術，克服了常規(guī)采樣法的耗時、干擾生命過程等問題，實現(xiàn)游離酚類化合物濃度的動態(tài)監(jiān)測。具體研究工作如下：

3、>　　 第一部分
　　 本研究基于在硫酸酸性介質(zhì)中，山奈酚對硫酸鈰－羅丹明6G的化學發(fā)光的增強作用，建立了高效液相色譜化學發(fā)光聯(lián)用（HPLC-CL）檢測大鼠血漿中山奈酚的新方法，采用C18柱，以甲醇－0.4％磷酸溶液（47:53，v/v）為流動相，流速為1.5mL·min-1進行等度洗脫。以異鼠李素為內(nèi)標，血漿樣品酸化后經(jīng)甲醇沉淀蛋白后直接進樣。山奈酚血藥濃度的線性范圍為2.0×10-9-2.0×10-6 g·mL-1 (r=

4、0.9991)，檢測限為1.0×10-9 g·mL-1。日內(nèi)和日間RSD均小于5.0％，回收率大于80.0％。該法靈敏度高，線性范圍寬，樣品前處理簡單，成功地應用于SD大鼠灌胃2500 mg·kg-1 BW和1250 mg·kg-1 BW山奈酚的藥動學研究，獲得了主要藥動學參數(shù)：2500 mg·kg-1 BW劑量組：Tmax=(1.21±0.46) h，Cmax=(232.90±5.14) ng·mL-1，AUC0-∞=(1728.41

5、±57.31) ng·h·mL-1，MRT0-∞=(13.38±3.87) h，T1/2=(9.27±1.84) h。 1250 mg·kg-1 BW劑量組：Tmax=(1.08±0.43) h，Cmax=(165.67±1.99) ng·mL-1，AUC0-∞=(729.01±29.44) ng·h·mL-1，MRT0-∞=(4.77±2.06) h，T1/2=(3.30±1.50) h。
　　 第二部分
　　 實驗一

6、
　　 本研究基于丹參酚類化合物對HAuCl4–luminol–H2O2化學發(fā)光體系的增強作用，建立了液相色譜–化學發(fā)光聯(lián)用測定六種丹參酚類化合物（丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、咖啡酸、丹酚酸B和丹酚酸A）的新方法。用Shim pack ODS色譜柱 (250×4.6 mm I.D.5μm)，以0.1％磷酸水溶液（v/v）和0.1％磷酸甲醇溶液（v/v）為流動相進行梯度洗脫，與化學發(fā)光在線檢測聯(lián)用，在26 min內(nèi)實現(xiàn)了六種丹參水

7、溶性成分的高選擇性和高靈敏分析。六種丹參水溶性成分的檢測限在0.03-6.72 ng·mL-1的范圍內(nèi)，精密度（RSD）均小于2.5％，測定樣品的回收率在95.3％到103.9％的范圍內(nèi)。本法選擇性好、靈敏度高，重復性好，被成功的用于測定復方丹參片、丹參滴注液、注射用丹參（凍干）和丹參藥材中水溶性成分的含量測定。
　　 實驗二
　　 本研究基于丹參酚類化合物對HAuCl4–luminol–H2O2化學發(fā)光體系的增強作用，

8、結合微透析采樣技術建立了丹參中六種水溶性酚類化合物（丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、咖啡酸、丹酚酸A和丹酚酸B）在大鼠血管和腦透析液中的含量測定方法。采用0.1％磷酸水溶液（v/v）和0.1％磷酸甲醇溶液（v/v）為流動相的HPLC梯度洗脫法，與HAuCl4–luminol–H2O2化學發(fā)光檢測聯(lián)用，在26 min內(nèi)實現(xiàn)了六種丹參酚類化合物的高選擇性和超靈敏分析，在林格液（灌流液）中的檢測限范圍為0.07-12.8 ng·mL-1，回收率的

9、范圍為92.04％-101.4％日內(nèi)和日間精密度為RSD小于6.5％。采用微透析體內(nèi)連續(xù)采樣技術，該法被成功應用于丹參滴注液（丹參素3.5mg·kg-1 BW，靜脈注射給藥）在大鼠血和腦中的藥代動力學研究。本實驗結合微透析采樣技術考察了丹參滴注液給藥后SD大鼠血和腦組織的藥動學。血管探針和腦探針分別插入頸靜脈和腦皮質(zhì)以林格液為灌流液，分別以2.0和0.8 μL·min-1的流速灌流。探針植入后平衡2 h，收集空白后，大鼠尾靜脈注射丹參滴

10、注液（丹參素3.5mg·kg-1 BW），收集微透析樣品，血液和腦組織透析液收集時間間隔分別為15和40 min，分別收集9個和4個樣品。結果實現(xiàn)了游離丹參素濃度的動態(tài)監(jiān)測，獲得了丹參素在血和腦中的藥代動力學參數(shù)：t1/2，AUC0-∞，和MRT0-∞。血管探針和腦探針對丹參素的體內(nèi)回收率分別為（34.89±0.06）％和（27.48±1.20）％（n=5）。給藥后大鼠血液和腦微透析液中均測得丹參素，而未測得原兒茶醛和丹酚酸B。丹參素透

11、過血腦屏障的系數(shù)（AUCbrain/AUCblood）高達0.25±0.07，提示丹參素為一個潛在的腦部保護劑。丹參滴注液靜脈給藥后丹參素在大鼠腦部的藥動學為國內(nèi)外首次報道。
　　 實驗三
　　 本研究基于丹參酚類化合物對HAuCl4–luminol–H2O2化學發(fā)光體系的增強作用，結合微透析采樣技術建立了丹參中3種水溶性酚類化合物（丹參素、原兒茶酸和原兒茶醛）在大鼠血管和腦透析液中的含量測定方法。用Shim pack

12、ODS色譜柱，甲醇-0.1％磷酸溶液（8: 92）為流動相進行等度洗脫，與化學發(fā)光檢測器聯(lián)用，在35min內(nèi)實現(xiàn)三種酚類化合物的高選擇性和超靈敏分析。血管和腦探針的植入灌流速度同實驗二，大鼠灌胃丹參藥材提取物（丹參素40 mg·kg-1 BW，原兒茶醛 149 mg·kg-1 BW）后，收集微透析樣品，血液和腦組織透析液收集時間間隔分別為15和30 min，收集血和腦微透析樣品，共收集4 h。丹參素、原兒茶醛和原兒茶酸在灌流液中的線性范

13、圍分別為2.29-179.0，3.46-345.6和4.80-800.0 ng·mL-1，檢測限分別為0.29，0.5184和0.80 ng·mL-1，日間和日內(nèi)RSD小于5.5％。大鼠灌胃丹參提取物后，血和腦微透析液中檢測到丹參素和原兒茶酸，而未檢測到原兒茶醛。采用3p87軟件，用統(tǒng)計矩求算丹參素和原兒茶酸的藥動學參數(shù)。二者透過血腦屏障的系數(shù)（AUCbrain/AUCblood）分別為0.25±0.04和0.09±0.02。表明丹參提