微透析液相色譜聯(lián)用的構(gòu)建及在經(jīng)皮藥動(dòng)學(xué)研究的應(yīng)用.pdf

1、研究目的：微透析(Microdialysis，MD)技術(shù)是近年來(lái)新興的一種生物活體取樣技術(shù)，它是利用物質(zhì)沿濃度梯度擴(kuò)散和半透膜對(duì)小分子化合物具有通透性的原理設(shè)計(jì)的，具有原位取樣、實(shí)時(shí)、在線、無(wú)需樣品預(yù)處理、動(dòng)態(tài)檢測(cè)等特點(diǎn)。其與色譜分析儀器聯(lián)合應(yīng)用為體內(nèi)藥物分析開辟了高效、精確、簡(jiǎn)便的新途徑．目前國(guó)外微透析技術(shù)已經(jīng)與多種色譜分析儀器進(jìn)行了在線聯(lián)用，形成了標(biāo)準(zhǔn)化商品，但其設(shè)備價(jià)格昂貴，國(guó)內(nèi)均依靠進(jìn)口，欲在我國(guó)推廣這一新的分析技術(shù)，設(shè)備的國(guó)產(chǎn)

2、化勢(shì)在必行。 中藥經(jīng)皮給藥系統(tǒng)在我國(guó)歷史悠久，目前評(píng)價(jià)中藥及其有效成分經(jīng)皮給藥的研究系統(tǒng)最常用的方法是應(yīng)用Franz擴(kuò)散池測(cè)定藥物的透皮速率，以此來(lái)預(yù)測(cè)藥物的生物等效性。但Fmnz擴(kuò)散池存在一些不足，如不能滿足溶液流體動(dòng)力學(xué)、離體皮膚的物理化學(xué)結(jié)構(gòu)和生理?xiàng)l件發(fā)生顯著差異等，都影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性與科學(xué)性。 因此將自行研制與構(gòu)建微透析與液相色譜在線聯(lián)用技術(shù)應(yīng)用到中藥經(jīng)皮給藥的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)與代謝研究中，克服了以往研究方法的不足

3、，為開展這一新技術(shù)創(chuàng)造了條件，提供了可靠和全新的手段。同時(shí)也為中藥現(xiàn)代化研究與中藥的質(zhì)量控制提供了的先進(jìn)、可行的新技術(shù)。 研究方法與結(jié)果： 1葛根素高效液相色譜條件的建立與離體大鼠皮膚體外滲透性實(shí)驗(yàn)研究 本研究建立了測(cè)定葛根素的高效液相色譜方法。色譜柱：Hypersil C18柱(5μm，4.6 mm×150 mm)；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：251nm；流動(dòng)相：甲醇：水(含0.1％醋酸)(30：70)；流速：1min·mL

4、-1；柱溫：室溫：25±0.1℃。藥物濃度與峰面積之間成良好線性關(guān)系。方法精密度好、準(zhǔn)確度高，符合分析要求。 采用改良Franz豎直擴(kuò)散池，以卡波姆、氮酮為輔料制備葛根素凝膠劑，離體大鼠皮膚為透皮屏障，用HPLC法測(cè)定葛根素的累積滲透量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，葛根素凝膠劑體外透皮釋藥時(shí)間累積透過(guò)量擬合方程：Q=11.12t-45.18，=0.9635，32 h累積滲透量為335.18±51.45μg/cm2。葛根素以一級(jí)動(dòng)力學(xué)透過(guò)皮膚，

5、所研制的葛根素經(jīng)皮給藥系統(tǒng)體外滲透性能良好，質(zhì)量控制方法簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確。 2微透析與高效液相色譜技術(shù)(離線)聯(lián)用對(duì)葛根素凝膠劑型經(jīng)皮給藥系統(tǒng)的藥代動(dòng)力學(xué)研究 本研究首次以中藥單體葛根素模型藥物，采用微透析取樣與高效液相色譜分析(離線)聯(lián)用技術(shù)(MD-HPLC off-line)，考察了其微透析探針體內(nèi)外回收率，繼而進(jìn)行了葛根素凝膠劑經(jīng)皮給藥系統(tǒng)的皮膚藥代動(dòng)力學(xué)和代謝過(guò)程的研究。所得數(shù)據(jù)經(jīng)kinetica軟件處理，得到葛

6、根素經(jīng)皮給藥后皮下葛根素濃度-時(shí)間曲線圖。其中藥時(shí)曲線下面積為(AUC)2335.14 ug·min·mL-1，半衰期為(T1/2)230.515 min，消除速率常數(shù)為(Lz)0.003，最大血藥濃度為(Cmax)4.62277 mg/mL與其所對(duì)應(yīng)的時(shí)間為(Tmax)460min。 3微透析與高效液相色譜在線聯(lián)用技術(shù)平臺(tái)的構(gòu)建 本研究在國(guó)內(nèi)率先自行研制與構(gòu)建微透析與高效液相色譜在線聯(lián)用平臺(tái)(MD-HPLC on-li

7、ne)，采用10孔自動(dòng)進(jìn)樣閥將微透析設(shè)備與高效液相色譜系統(tǒng)，通過(guò)聚丙烯、聚醚醚酮、彈性熔融石英毛細(xì)管三種材質(zhì)的管路，經(jīng)美國(guó)CYBERBOND(Apollo)瞬間生物兼容性粘合劑粘合而聯(lián)為一體。實(shí)現(xiàn)軟件聯(lián)動(dòng)，最終達(dá)到10孔自動(dòng)進(jìn)樣閥進(jìn)樣的同時(shí)，高效液相色譜系統(tǒng)檢測(cè)器對(duì)樣品同時(shí)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，儀器性能數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS軟件，配對(duì)T檢驗(yàn)對(duì)3種濃度(0.1ug/ml，10ug/ml，100ug/ml)的葛根素出峰時(shí)間理論值與實(shí)測(cè)值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P0

8、.1=0.239，P10=0.617，P100=0.809，P值均大于0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，既葛根素的理論值和實(shí)測(cè)值沒(méi)有顯著性差異。因此得出結(jié)論，本實(shí)驗(yàn)建立的VCOM和CLASS-VP軟件分別控制10孔自動(dòng)進(jìn)樣閥和HPLC系統(tǒng)，可以做到進(jìn)樣和檢測(cè)同步完成，儀器精密、準(zhǔn)確，完全可以達(dá)到實(shí)驗(yàn)的要求，實(shí)現(xiàn)了微透析取樣與高效液相色譜檢測(cè)在線聯(lián)動(dòng)。儀器設(shè)備價(jià)格低廉、簡(jiǎn)便實(shí)用，經(jīng)濟(jì)可靠。這將成為國(guó)內(nèi)第一臺(tái)自行構(gòu)建并投入實(shí)用的在線聯(lián)用裝置，為推動(dòng)這

9、一新技術(shù)在我國(guó)的廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。 4微透析與高效液相色譜離線與自制在線聯(lián)用平臺(tái)性能的考察與比較 本研究以葛根素為模型藥物，測(cè)定MD-HPLC off-line與自制的MD-HPLC on-line的儀器精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性等相關(guān)參數(shù)，考察MD-HPLC on-line儀器性能，發(fā)現(xiàn)與解決存在的問(wèn)題，進(jìn)一步改進(jìn)與完善該系統(tǒng)，數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，具體結(jié)果如下所示： 1)回歸方程中相關(guān)系數(shù)(r在線

10、=r離線=1)，回歸系數(shù)(b在線=31304，b離線=29369)分別進(jìn)行F檢驗(yàn)(F在線=168959.6，P在線=0.0001，F(xiàn)離線=71114.847，P離線=0.0001)和t檢驗(yàn)(t在線=411.047，P在線=0.0001，t離線=266.674，P離線=0.0001)，P值均小于0.05。結(jié)果提示，在線和離線回歸方程中相關(guān)系數(shù)、回歸系數(shù)本身具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且自行研制的MD-HPLC on-line測(cè)定濃度和葛根素峰面積的相

11、關(guān)性與MD-HPLC off-line無(wú)明顯差異。進(jìn)一步對(duì)兩回歸方程中的回歸系數(shù)進(jìn)行F檢驗(yàn)，反應(yīng)其差值是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用General linear model觀察其交互性參數(shù)，F(xiàn)=208.967，P=0.0001，P值均小于0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果提示，自行研制的MD-HPLC on-line與MD-HPLC off-line測(cè)定同一濃度葛根素樣品時(shí)，MD-HPLC on-line所測(cè)得的峰面積響應(yīng)值優(yōu)于MD-HPLCoff

12、-line。 2)精密度(日內(nèi))數(shù)據(jù)經(jīng)兩組比較t檢驗(yàn)分析：t0.1=46.862，P0.1=0.0001；t10=5.035，P10=0.001；t100=7.090，P100=0.0001，P值均小于0.05，且3種濃度葛根素峰面積SD在線＜SD離線。結(jié)果提示：自行研制的MD-HPLC on-line與MD=HPLC off-line測(cè)定低、中、高3種濃度葛根素樣品時(shí)，MD-HPLC on-line日內(nèi)精密度優(yōu)于MD-HPLC

13、off-line，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。精密度(日內(nèi))數(shù)據(jù)經(jīng)兩組比較t檢驗(yàn)分析：t0.1=37.222，P0.1=0.0001；t0.1=5.669，P0.1=0.0001；t0.1=12.226，P0.1=0.0001，P值均小于0.05，且3種濃度葛根素峰面積SD在線＜SD離線。結(jié)果提示：自行研制的MD-HPLC on-line與MD-HPLC off-line測(cè)定低、中、高3種濃度葛根素樣品時(shí)，MD-HPLC on-lme日間精密度優(yōu)于

14、MD-HPLC off-line，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3)重現(xiàn)性數(shù)據(jù)經(jīng)兩組比較t檢驗(yàn)分析：SD在線=8352.453，SD離線=22953.676，SD在線＜SD離線；t=24.353，P=0.001，P＜0.05。結(jié)果提示：自行研制的MD-HPLC on-line和MD-HPLC off-line測(cè)定葛根素樣品時(shí)，MD-HPLC on-line重現(xiàn)性優(yōu)于MD-HPLCoff-line，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4)穩(wěn)定性數(shù)據(jù)經(jīng)兩

15、組配對(duì)t檢驗(yàn)分析：SD在線=1741.153，SD離線=2007.673，SD在線＜SD離線：t=7.855，P=0.001，P＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果提示：自行研制的MD-HPLCon-line與MD-HPLC off-line測(cè)定葛根素樣品時(shí)，MD-HPLC on-line穩(wěn)定性優(yōu)于MD-HPLC off-line，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 5微透析與高效液相色譜在線聯(lián)用技術(shù)對(duì)阿魏酸線性探針的校正 本研究首次采用自行研

16、制與構(gòu)建微透析與高效液相色譜在線聯(lián)用平臺(tái)，對(duì)見光或受熱后極易發(fā)生異構(gòu)化進(jìn)而降解的中藥單體成分阿魏酸進(jìn)行了線性微透析探針的體內(nèi)外回收率校正。 6微透析與高效液相色譜在線聯(lián)用技術(shù)在中藥經(jīng)皮給藥系統(tǒng)體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)中的應(yīng)用 本研究首次采用自行研制與構(gòu)建的微透析與高效液相色譜在線聯(lián)用平臺(tái)與技術(shù)，對(duì)大鼠皮下的線性微透析探針與頸靜脈中的血管微透析探針同時(shí)取樣，實(shí)現(xiàn)同步、實(shí)時(shí)、在線監(jiān)測(cè)，以全面反映葛根素凝膠制劑給藥后在大鼠皮膚與血液

17、中的葛根素藥代動(dòng)力學(xué)代謝過(guò)程，數(shù)據(jù)經(jīng)Kinetica軟件處理分析，得到葛根素凝膠經(jīng)皮給藥后皮下和血管內(nèi)葛根素濃度-時(shí)間曲線圖。線性微透析探針：藥時(shí)曲線下面積為(AUC)3662ug·min·mL-1，半衰期為(T1/2)519 min，消除速率常數(shù)為(Lz)0.0018，最大血藥濃度為(Cmax)9.6483ug/mL與其所對(duì)應(yīng)的時(shí)間為(Tmax)381 min；血管微透析探針：藥時(shí)曲線下面積為(AUC)2391.11ug·min·ml

18、-1，半衰期為(T1/2)250 min，消除速率常數(shù)為(Lz)0.0027，最大血藥濃度為(Cmax)14.6563 ug/ml與其所對(duì)應(yīng)的時(shí)間為(Tmax)48 min。 結(jié)論：本項(xiàng)目自行研制微透析取樣與高效液相色譜在線聯(lián)用(MD-HPLC on-line)設(shè)備，價(jià)格低廉、簡(jiǎn)便實(shí)用，把這一新技術(shù)的開展引入國(guó)內(nèi)。同時(shí)應(yīng)用這一技術(shù)進(jìn)行具有我國(guó)特色的傳統(tǒng)中藥及其有效成分的經(jīng)皮給藥系統(tǒng)研究，為中藥質(zhì)量可控性、標(biāo)準(zhǔn)化、以及藥代動(dòng)力學(xué)與