微透析液相色譜聯(lián)用的構(gòu)建及在經(jīng)皮藥動學研究的應用.pdf

1、研究目的：微透析(Microdialysis，MD)技術(shù)是近年來新興的一種生物活體取樣技術(shù)，它是利用物質(zhì)沿濃度梯度擴散和半透膜對小分子化合物具有通透性的原理設(shè)計的，具有原位取樣、實時、在線、無需樣品預處理、動態(tài)檢測等特點。其與色譜分析儀器聯(lián)合應用為體內(nèi)藥物分析開辟了高效、精確、簡便的新途徑．目前國外微透析技術(shù)已經(jīng)與多種色譜分析儀器進行了在線聯(lián)用，形成了標準化商品，但其設(shè)備價格昂貴，國內(nèi)均依靠進口，欲在我國推廣這一新的分析技術(shù)，設(shè)備的國產(chǎn)

2、化勢在必行。 中藥經(jīng)皮給藥系統(tǒng)在我國歷史悠久，目前評價中藥及其有效成分經(jīng)皮給藥的研究系統(tǒng)最常用的方法是應用Franz擴散池測定藥物的透皮速率，以此來預測藥物的生物等效性。但Fmnz擴散池存在一些不足，如不能滿足溶液流體動力學、離體皮膚的物理化學結(jié)構(gòu)和生理條件發(fā)生顯著差異等，都影響實驗數(shù)據(jù)的準確性與科學性。 因此將自行研制與構(gòu)建微透析與液相色譜在線聯(lián)用技術(shù)應用到中藥經(jīng)皮給藥的體內(nèi)藥動學與代謝研究中，克服了以往研究方法的不足

3、，為開展這一新技術(shù)創(chuàng)造了條件，提供了可靠和全新的手段。同時也為中藥現(xiàn)代化研究與中藥的質(zhì)量控制提供了的先進、可行的新技術(shù)。 研究方法與結(jié)果： 1葛根素高效液相色譜條件的建立與離體大鼠皮膚體外滲透性實驗研究 本研究建立了測定葛根素的高效液相色譜方法。色譜柱：Hypersil C18柱(5μm，4.6 mm×150 mm)；紫外檢測波長：251nm；流動相：甲醇：水(含0.1％醋酸)(30：70)；流速：1min·mL

4、-1；柱溫：室溫：25±0.1℃。藥物濃度與峰面積之間成良好線性關(guān)系。方法精密度好、準確度高，符合分析要求。 采用改良Franz豎直擴散池，以卡波姆、氮酮為輔料制備葛根素凝膠劑，離體大鼠皮膚為透皮屏障，用HPLC法測定葛根素的累積滲透量。實驗結(jié)果表明，葛根素凝膠劑體外透皮釋藥時間累積透過量擬合方程：Q=11.12t-45.18，=0.9635，32 h累積滲透量為335.18±51.45μg/cm2。葛根素以一級動力學透過皮膚，

5、所研制的葛根素經(jīng)皮給藥系統(tǒng)體外滲透性能良好，質(zhì)量控制方法簡便、快捷、準確。 2微透析與高效液相色譜技術(shù)(離線)聯(lián)用對葛根素凝膠劑型經(jīng)皮給藥系統(tǒng)的藥代動力學研究 本研究首次以中藥單體葛根素模型藥物，采用微透析取樣與高效液相色譜分析(離線)聯(lián)用技術(shù)(MD-HPLC off-line)，考察了其微透析探針體內(nèi)外回收率，繼而進行了葛根素凝膠劑經(jīng)皮給藥系統(tǒng)的皮膚藥代動力學和代謝過程的研究。所得數(shù)據(jù)經(jīng)kinetica軟件處理，得到葛

6、根素經(jīng)皮給藥后皮下葛根素濃度-時間曲線圖。其中藥時曲線下面積為(AUC)2335.14 ug·min·mL-1，半衰期為(T1/2)230.515 min，消除速率常數(shù)為(Lz)0.003，最大血藥濃度為(Cmax)4.62277 mg/mL與其所對應的時間為(Tmax)460min。 3微透析與高效液相色譜在線聯(lián)用技術(shù)平臺的構(gòu)建 本研究在國內(nèi)率先自行研制與構(gòu)建微透析與高效液相色譜在線聯(lián)用平臺(MD-HPLC on-li

7、ne)，采用10孔自動進樣閥將微透析設(shè)備與高效液相色譜系統(tǒng)，通過聚丙烯、聚醚醚酮、彈性熔融石英毛細管三種材質(zhì)的管路，經(jīng)美國CYBERBOND(Apollo)瞬間生物兼容性粘合劑粘合而聯(lián)為一體。實現(xiàn)軟件聯(lián)動，最終達到10孔自動進樣閥進樣的同時，高效液相色譜系統(tǒng)檢測器對樣品同時進行監(jiān)測，儀器性能數(shù)據(jù)應用SPSS軟件，配對T檢驗對3種濃度(0.1ug/ml，10ug/ml，100ug/ml)的葛根素出峰時間理論值與實測值，進行統(tǒng)計學分析，P0

8、.1=0.239，P10=0.617，P100=0.809，P值均大于0.05，無統(tǒng)計學意義，既葛根素的理論值和實測值沒有顯著性差異。因此得出結(jié)論，本實驗建立的VCOM和CLASS-VP軟件分別控制10孔自動進樣閥和HPLC系統(tǒng)，可以做到進樣和檢測同步完成，儀器精密、準確，完全可以達到實驗的要求，實現(xiàn)了微透析取樣與高效液相色譜檢測在線聯(lián)動。儀器設(shè)備價格低廉、簡便實用，經(jīng)濟可靠。這將成為國內(nèi)第一臺自行構(gòu)建并投入實用的在線聯(lián)用裝置，為推動這

9、一新技術(shù)在我國的廣泛應用奠定了基礎(chǔ)。 4微透析與高效液相色譜離線與自制在線聯(lián)用平臺性能的考察與比較 本研究以葛根素為模型藥物，測定MD-HPLC off-line與自制的MD-HPLC on-line的儀器精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性等相關(guān)參數(shù)，考察MD-HPLC on-line儀器性能，發(fā)現(xiàn)與解決存在的問題，進一步改進與完善該系統(tǒng)，數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析，具體結(jié)果如下所示： 1)回歸方程中相關(guān)系數(shù)(r在線

10、=r離線=1)，回歸系數(shù)(b在線=31304，b離線=29369)分別進行F檢驗(F在線=168959.6，P在線=0.0001，F(xiàn)離線=71114.847，P離線=0.0001)和t檢驗(t在線=411.047，P在線=0.0001，t離線=266.674，P離線=0.0001)，P值均小于0.05。結(jié)果提示，在線和離線回歸方程中相關(guān)系數(shù)、回歸系數(shù)本身具有統(tǒng)計學意義，且自行研制的MD-HPLC on-line測定濃度和葛根素峰面積的相

11、關(guān)性與MD-HPLC off-line無明顯差異。進一步對兩回歸方程中的回歸系數(shù)進行F檢驗，反應其差值是否具有統(tǒng)計學意義。采用General linear model觀察其交互性參數(shù)，F(xiàn)=208.967，P=0.0001，P值均小于0.05，有統(tǒng)計學意義。結(jié)果提示，自行研制的MD-HPLC on-line與MD-HPLC off-line測定同一濃度葛根素樣品時，MD-HPLC on-line所測得的峰面積響應值優(yōu)于MD-HPLCoff

12、-line。 2)精密度(日內(nèi))數(shù)據(jù)經(jīng)兩組比較t檢驗分析：t0.1=46.862，P0.1=0.0001；t10=5.035，P10=0.001；t100=7.090，P100=0.0001，P值均小于0.05，且3種濃度葛根素峰面積SD在線＜SD離線。結(jié)果提示：自行研制的MD-HPLC on-line與MD=HPLC off-line測定低、中、高3種濃度葛根素樣品時，MD-HPLC on-line日內(nèi)精密度優(yōu)于MD-HPLC

13、off-line，且有統(tǒng)計學意義。精密度(日內(nèi))數(shù)據(jù)經(jīng)兩組比較t檢驗分析：t0.1=37.222，P0.1=0.0001；t0.1=5.669，P0.1=0.0001；t0.1=12.226，P0.1=0.0001，P值均小于0.05，且3種濃度葛根素峰面積SD在線＜SD離線。結(jié)果提示：自行研制的MD-HPLC on-line與MD-HPLC off-line測定低、中、高3種濃度葛根素樣品時，MD-HPLC on-lme日間精密度優(yōu)于

14、MD-HPLC off-line，且有統(tǒng)計學意義。 3)重現(xiàn)性數(shù)據(jù)經(jīng)兩組比較t檢驗分析：SD在線=8352.453，SD離線=22953.676，SD在線＜SD離線；t=24.353，P=0.001，P＜0.05。結(jié)果提示：自行研制的MD-HPLC on-line和MD-HPLC off-line測定葛根素樣品時，MD-HPLC on-line重現(xiàn)性優(yōu)于MD-HPLCoff-line，且有統(tǒng)計學意義。 4)穩(wěn)定性數(shù)據(jù)經(jīng)兩

15、組配對t檢驗分析：SD在線=1741.153，SD離線=2007.673，SD在線＜SD離線：t=7.855，P=0.001，P＜0.05，有統(tǒng)計學意義。結(jié)果提示：自行研制的MD-HPLCon-line與MD-HPLC off-line測定葛根素樣品時，MD-HPLC on-line穩(wěn)定性優(yōu)于MD-HPLC off-line，且有統(tǒng)計學意義。 5微透析與高效液相色譜在線聯(lián)用技術(shù)對阿魏酸線性探針的校正 本研究首次采用自行研

16、制與構(gòu)建微透析與高效液相色譜在線聯(lián)用平臺，對見光或受熱后極易發(fā)生異構(gòu)化進而降解的中藥單體成分阿魏酸進行了線性微透析探針的體內(nèi)外回收率校正。 6微透析與高效液相色譜在線聯(lián)用技術(shù)在中藥經(jīng)皮給藥系統(tǒng)體內(nèi)藥物代謝動力學中的應用 本研究首次采用自行研制與構(gòu)建的微透析與高效液相色譜在線聯(lián)用平臺與技術(shù)，對大鼠皮下的線性微透析探針與頸靜脈中的血管微透析探針同時取樣，實現(xiàn)同步、實時、在線監(jiān)測，以全面反映葛根素凝膠制劑給藥后在大鼠皮膚與血液

17、中的葛根素藥代動力學代謝過程，數(shù)據(jù)經(jīng)Kinetica軟件處理分析，得到葛根素凝膠經(jīng)皮給藥后皮下和血管內(nèi)葛根素濃度-時間曲線圖。線性微透析探針：藥時曲線下面積為(AUC)3662ug·min·mL-1，半衰期為(T1/2)519 min，消除速率常數(shù)為(Lz)0.0018，最大血藥濃度為(Cmax)9.6483ug/mL與其所對應的時間為(Tmax)381 min；血管微透析探針：藥時曲線下面積為(AUC)2391.11ug·min·ml

18、-1，半衰期為(T1/2)250 min，消除速率常數(shù)為(Lz)0.0027，最大血藥濃度為(Cmax)14.6563 ug/ml與其所對應的時間為(Tmax)48 min。 結(jié)論：本項目自行研制微透析取樣與高效液相色譜在線聯(lián)用(MD-HPLC on-line)設(shè)備，價格低廉、簡便實用，把這一新技術(shù)的開展引入國內(nèi)。同時應用這一技術(shù)進行具有我國特色的傳統(tǒng)中藥及其有效成分的經(jīng)皮給藥系統(tǒng)研究，為中藥質(zhì)量可控性、標準化、以及藥代動力學與