藥用栽培牡丹分子標(biāo)記及其有效成分對(duì)血管內(nèi)皮炎癥損傷的保護(hù)作用研究.pdf

1、近年來，分子標(biāo)記技術(shù)和DNA指紋分析技術(shù)的迅猛發(fā)展及其在農(nóng)作物種質(zhì)鑒定上的廣泛應(yīng)用，為揭示藥用植物的遺傳差異和鑒定中藥材品種的道地性提供了新的方法和手段，其中核糖體DNA（即nrDNA）ITS區(qū)（包括ITS-1，5.8s和ITS-2）基因片段短，擴(kuò)增和測(cè)序容易而越來越廣泛的用于分類學(xué)研究，而在被子植物中既有核苷酸序列的高度變異又有長(zhǎng)度上的保守性，也使其序列很容易在近緣類群間排序，另外其豐富的變異還可在較低的分類階元（屬間、種間及種下等級(jí)

2、）解決植物系統(tǒng)發(fā)育問題。在這些研究中首先需要得到高質(zhì)量的藥材基因組DNA。通常采用新鮮葉片進(jìn)行處理較易得到目的DNA，但對(duì)于干藥材的DNA提取采用傳統(tǒng)方法有一定的難度，特別是根皮類藥材，由于含有大量的多糖、蛋白及次生代謝物嚴(yán)重干擾基因組DNA的提取效果。 研究證實(shí)，炎癥因子（IL-8、NO等）在動(dòng)脈粥樣硬化疾病的起始、發(fā)生及發(fā)展中扮演著非常重要的角色。丹皮酚（Paeonol，Pae）作為毛茛科植物牡丹（Paeorua sufru

3、ticosa Andr）根皮的主要活性成分之一具有驅(qū)瘀止血、抗菌消炎、鎮(zhèn)靜解痙、退熱止痛等廣泛的藥理作用。 本實(shí)驗(yàn)，首先在CTAB法基礎(chǔ)上通過對(duì)提取過程中不同影響因素的考察建立一種較為完善、經(jīng)濟(jì)、快速的根皮類中藥材DNA的提取方法。使用經(jīng)過改進(jìn)后的CTAB法獲得的DNA純度和完整性較好，A260/A280比值在1.8～2.0之間，PCR擴(kuò)增條帶清晰且亮，從而為接下來的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)打下良好的基礎(chǔ)。 其次，對(duì)我國(guó)四個(gè)地區(qū)牡

4、丹主要栽培品種rDNA ITS區(qū)序列測(cè)定，研究各居群rDNA ITS序列特征及差異，建立不同地區(qū)主要牡丹栽培品種的區(qū)域性分子標(biāo)記，參照GeneB ank信息（登錄號(hào)：U27692）利用Clustal X、MEGA3.1分子進(jìn)化遺傳分析軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果排序。牡丹ITS全序列長(zhǎng)度為652 bp，相對(duì)于GenB ank中牡丹rDNA ITS全序列在448位少一個(gè)C堿基，其中ITS1為267 bp，5.8 S為163 bp，ITS2為222 bp

5、，GC含量為55.7％～56.9％，共有30個(gè)變異位點(diǎn)，主要發(fā)生在ITS1、ITS2區(qū)，5.8S區(qū)也存在多個(gè)位點(diǎn)的變異。 再次，觀察丹皮酚（Paeonol，Pae）在體外對(duì)脂多糖（LPS）作用下的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）炎癥因子（IL-8、NO）表達(dá)的影響，通過LPS體外作用于HUVECs，MTT法檢測(cè)Paeonol對(duì)HUVECs增殖抑制作用，RT-PCR法檢測(cè)IL-8 mRNA的表達(dá)，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞胞內(nèi)NO，流式

6、細(xì)胞儀檢測(cè)胞內(nèi)NO含量、細(xì)胞周期分布及細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果可見Paeonol可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞在LPS刺激下的IL-8及IL-8 mRNA的表達(dá)，相反提高了由于LPS引起的NO含量下降及NOS活性的降低。另外，Paeonol可減少由于LPS刺激下的細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的改變。 綜上所述，rDNA ITS序列可用于牡丹rDNA ITS區(qū)序列特征（SNPs）及不同地區(qū)主要牡丹栽培品種的鑒別。牡丹皮主要活性成分Paeonol可改變LPS作用