經(jīng)方“大黃附子湯”及其有效成分保護腎小管損傷分子機制的研究.pdf

1、背景及目的：
　　目前，在世界范圍內(nèi)，慢性腎臟病(CKD)已經(jīng)成為危害公眾健康的重大公共衛(wèi)生問題。研究表明，腎小管損傷是CKD進展至終末期腎病的主要病理特征之一。腎小管損傷主要是指腎小管上皮細胞死亡，其形式包括“壞死、凋亡和自噬”，其中，“細胞凋亡”和“細胞自噬”是影響腎小管上皮細胞死亡的重要調(diào)控機制;細胞凋亡與TGF-β1/JNK信號通路密切相關，細胞自噬與AMPK/mTOR/p70S6K和MAPKs信號通路密切相關。經(jīng)方“大黃

2、附子湯(DFD)”（《金匱要略》）作為“溫陽泄?jié)岱ā钡拇硇灾兴帍头?，在臨床上廣泛運用于治療各類CKD，而且，有一定的療效。國內(nèi)外的既往研究表明，DFD及其有效成分大黃酸在體內(nèi)外具有抗凋亡或抗纖維化的作用，然而，相關的分子藥理機制不甚清楚。因此，筆者提出假說:經(jīng)方“大黃附子湯”及其有效成分“大黃酸”可能通過調(diào)控細胞凋亡或細胞自噬而保護腎小管損傷。基于此，首先，筆者闡明DFD在體內(nèi)減輕細胞凋亡保護腎小管損傷的作用和機制;其次，揭示DFD和

3、大黃（DFD的“君藥”）在體內(nèi)干預自噬改善腎小管損傷的作用和機制;最后，研究DFD有效成分——“大黃酸”在體外干預自噬調(diào)節(jié)腎小管損傷的分子機制。
　　方法:
　　1.在第一組實驗中，筆者將27只SD大鼠隨機分成正常組(A)、模型組(B)、大黃附子湯組(C)、別嘌呤醇組(D)。在實驗開始后的第1-14天期間，經(jīng)灌胃給予B、C、D組大鼠腺嘌呤混懸液(150 mg/kg·d)而建立腎小管損傷（腎衰竭）動物模型;在第15-35天期間

4、，分別用大黃附子湯(2.5 g/kg·d)和別嘌呤醇(0.03 g/kg·d)給C、D組大鼠灌胃;同時，用蒸餾水給A、B組大鼠灌胃。在給藥的過程中，每隔3天，連續(xù)用腺嘌呤混懸液(150 mg/kg·d)給B、C、D組大鼠灌胃，以維持模型鼠腎功能在一定的損傷水平。在實驗過程中，每周稱大鼠體重，在造模前后和藥物干預后第3周末（實驗開始后的第35天），分別檢測血清尿素氮(BUN)、血清肌酐(Scr)、血清尿酸(SUA)以及24h尿蛋白排泄量(

5、Upro)、尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(UNAG)。在藥物干預后第3周末，處死全部大鼠，留取血液標本，摘取雙腎，稱重，留取腎臟標本，觀察腎臟外觀、腎小管/間質(zhì)形態(tài)特征和腎小管上皮細胞凋亡特征（包括TUNEL染色以及腎組織Bcl-2、Bax和Cleaved caspase-3蛋白表達水平等）等;檢測血清和尿液生化指標、腎組織TGF-β1/JNK信號通路相關信號分子TGF-β1、JNK和p-JNK蛋白表達水平。該組實驗試圖闡明大黃附

6、子湯在體內(nèi)減輕細胞凋亡保護腎小管損傷的作用和機制。
　　2.在第二組實驗中，筆者將33只SD大鼠隨機分成正常組(A)、模型組(B)、大黃附子湯組(C)、大黃組(D)和纈沙坦組(E)。在實驗開始后的第1-14天期間，經(jīng)灌胃給予B、C、D、E組大鼠腺嘌呤混懸液(150 mg/kg· d)而建立腎小管損傷（腎衰竭）動物模型;在第15-35天期間，分別用大黃附子湯(2.5 g/kg· d)、大黃溶液(1 g/kg·d)和纈沙坦溶液(8 m

7、g/kg·d)給C、D、E組大鼠灌胃;同時，用蒸餾水給A、B組大鼠灌胃。在給藥的過程中，每隔3天，連續(xù)用腺嘌呤混懸液(150 mg/kg·d)給B、C、D、E組大鼠灌胃，以維持模型鼠腎功能在一定的損傷水平。在藥物干預后的第3周末，處死全部大鼠，采集腎組織，進行自噬指標——LC3以及腎臟纖維化指標——CollagenⅠ和Fibronectin的免疫組化染色及蛋白表達水平檢測。該組實驗試圖揭示大黃附子湯和大黃在體內(nèi)干預自噬改善腎小管損傷的作

8、用和機制。
　　3.在第三組實驗中，筆者用Hank's平衡鹽溶液(HBSS)誘導腎小管上皮細胞(NRK-52E)細胞產(chǎn)生饑餓狀態(tài)，發(fā)生自噬，同時，聯(lián)合或不聯(lián)合大黃酸，檢測LC3Ⅰ/Ⅱ的蛋白表達水平，Akt/AMPK/mTOR/p70S6K信號通路相關信號分子p-Akt Ser473、Akt、p-AMPK、AMPK、mTOR、p-mTOR Ser2448、p-p70S6K的蛋白表達水平以及MAPKs信號通路相關信號分子p-p38、p

9、-Erk和p-JNK的蛋白表達水平。用HBSS和巴佛洛霉素A1（Bafilomycin A1，自噬抑制劑）聯(lián)合或不聯(lián)合大黃酸干預NRK-52E細胞，用HBSS和大黃酸聯(lián)合或不聯(lián)合雷帕霉素（Rapamycin，mTOR抑制劑）干預NRK-52E細胞，用HBSS聯(lián)合或不聯(lián)合大黃酸干預轉(zhuǎn)染或不轉(zhuǎn)染Deptor質(zhì)粒（mTOR抑制劑）的NRK-52E細胞，以及用HBSS聯(lián)合或不聯(lián)合SB203580（p38抑制劑）或PD098059（Erk抑制劑）

10、干預NRK-52E細胞，檢測LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白表達;用HBSS和大黃酸聯(lián)合或不聯(lián)合二甲雙胍（Metformin，AMPK激動劑）干預NRK-52E細胞，檢測LC3Ⅰ/Ⅱ、p-AMPK、AMPK和p-p70S6K蛋白表達。用HBSS和Bafilomycin A1聯(lián)合或不聯(lián)合大黃酸、SB203580或PD098059，用HBSS、Bafilomycin A1和大黃酸聯(lián)合或不聯(lián)合Metformin，干預轉(zhuǎn)染了mRFP-LC3質(zhì)粒的NRK-52E

11、和Hela細胞，觀察mRFP-LC3熒光顆粒情況。該組實驗試圖研究DFD有效成分——“大黃酸”在體外干預自噬調(diào)節(jié)腎小管損傷的分子機制。
　　結(jié)果:
　　1.經(jīng)灌胃給予腺嘌呤14天后，模型鼠Upro、UNAG、BUN、Scr、SUA明顯升高，出現(xiàn)腎小管/間質(zhì)病變和腎小管上皮細胞凋亡。在藥物干預3周后，DFD、別嘌呤醇能改善模型鼠腎功能、Upro和UNAG，減輕腎小管上皮細胞凋亡，緩解腎間質(zhì)纖維化程度，下調(diào)腎組織Bax和Clea

12、ved caspase-3蛋白表達，上調(diào)Bcl-2蛋白表達，并且，抑制TGF-β1和p-JNK蛋白表達。大黃附子湯組的各項指標優(yōu)于別嘌呤醇組。
　　2.經(jīng)灌胃給予腺嘌呤14天后，模型組大鼠腎組織內(nèi)腎小管擴張明顯，腎小管上皮細胞脫落，腎間質(zhì)面積增加，模型鼠腎組織LC3、CollagenⅠ和Fibronectin免疫組化染色及蛋白表達明顯增強。在DFD、大黃和纈沙坦干預3周后，腎小管擴張、腎小管上皮細胞脫落和間質(zhì)面積增加稍有改善，模型

13、鼠LC3、CollagenⅠ和Fibronectin免疫組化染色和蛋白表達明顯減輕。DFD、大黃和纈沙坦三組之間各項指標差異無統(tǒng)計學意義。
　　3.(1)大黃酸抑制HBSS誘導NRK-52E細胞的LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)化，同時抑制HBSS和Bafilomycin A1誘導的LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)化和mRFP-LC3熒光顆粒，說明大黃酸可以抑制HBSS誘導的NRK-52E細胞自噬;(2)大黃酸增加HBSS抑制的p-mTOR Ser244

14、8和p-p70S6K蛋白表達，Rapamycin逆轉(zhuǎn)HBSS和大黃酸共同干預抑制的LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)化，大黃酸不能抑制HBSS誘導轉(zhuǎn)染了Deptor質(zhì)粒的NRK-52E細胞LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)化，說明大黃酸抑制HBSS誘導的NRK-52E細胞自噬，可能是通過激活mTOR/p70S6K信號通路實現(xiàn)的;(3)大黃酸抑制HBSS誘導NRK-52E細胞p-AMPK蛋白表達，而對p-Akt Ser473蛋白表達沒有明顯影響，Metformin能

15、逆轉(zhuǎn)HBSS和大黃酸聯(lián)合干預NRK-52E細胞抑制的LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)化、p-AMPK蛋白表達和促進的p-p70S6K蛋白表達，Metformin還能促進大黃酸抑制HBSS和Bafilomycin A1聯(lián)合干預誘導的mRFP-LC3熒光顆粒，說明大黃酸抑制HBSS誘導的NRK-52E細胞自噬，不是通過Akt信號通路，而是通過AMPK信號通路實現(xiàn)的;(4)大黃酸抑制HBSS誘導NRK-52E細胞p-p38和p-Erk蛋白表達，而對p-J

16、NK蛋白表達無明顯影響，SB203580和PD098059均能抑制HBSS誘導NRK-52E細胞的LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)化，以及HBSS和BafilomycinA1聯(lián)合干預誘導的mRFP-LC3熒光顆粒，說明大黃酸抑制HBSS誘導的NRK-52E細胞自噬，可能是通過抑制p38和Erk MAPKs信號通路實現(xiàn)的，大黃酸可能具有類似于p38和Erk抑制劑的作用。
　　結(jié)論:
　　1.DFD在體內(nèi)可能是通過下調(diào)腺嘌呤誘導腎小管損傷模

17、型鼠腎組織中TGF-β1和p-JNK蛋白表達，干擾TGF-β1/JNK通路中相關信號轉(zhuǎn)導，進而減輕模型鼠腎小管上皮細胞凋亡和緩解腎間質(zhì)纖維化。因此，TGF-β1/JNK通路既是調(diào)控細胞凋亡的重要途徑，也是DFD保護模型鼠腎小管損傷的作用靶點。
　　2.DFD和大黃在體內(nèi)不僅可以改善腺嘌呤誘導腎小管損傷模型鼠腎小管擴張、腎小管上皮細胞脫落和間質(zhì)面積增加，而且還能減少腎臟LC3、CollagenⅠ和Fibronectin蛋白表達。因此