紫草有效成分抗癌應(yīng)用探索及其分子機(jī)制的研究.pdf

1、目的:紫草是我國傳統(tǒng)中藥,具有清熱,解毒的功效。千百年來被用于治療斑疹,麻疹,咽喉痛,癰以及燒傷。近期內(nèi)有臨床研究表明紫草對于治療癌癥特別是肝癌和肺癌具有較好的效果,本文的目的即是研究紫草有效成分抗癌作用的分子機(jī)制。
　　 方法:本課題為研究紫草及其衍生物對癌細(xì)胞抑制作用的分子機(jī)制,在藥理學(xué)作用觀察方面采用MTT作用于活細(xì)胞中的呼吸鏈,表征藥物對細(xì)胞增殖的影響,來考查其對癌細(xì)胞的的生長抑制作用。同時用DAPI對細(xì)胞核進(jìn)行染色,觀

2、察藥物作用下癌細(xì)胞的細(xì)胞核是否呈現(xiàn)染色質(zhì)邊緣化,出現(xiàn)凋亡小體,核固縮等凋亡形態(tài)。為進(jìn)一步研究靶標(biāo)藥物促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制,采用Ligand Binding分析其與RXR蛋白的配體9-cis的競爭性親和效應(yīng),3H標(biāo)記的9-cis在閃爍液中的cpm值可以量化紫草中競爭性結(jié)合RXR蛋白成分的結(jié)合能力。另外Western Blotting的方法研究不同濃度軟紫草提取物處理后對癌細(xì)胞RXR蛋白穩(wěn)定性的影響。為選出一個具有代表性的紫草成分及其衍

3、生物,再次采用MTT assay的方法對紫草提取物中的主要成分及其衍生物在不同濃度下對肺癌細(xì)胞H460的增殖抑制情況,比較其生長抑制曲線,選擇了效果最為明顯的SK02作為我們進(jìn)一步研究的單組分藥物,來進(jìn)行更多的相關(guān)實驗研究。實驗中我們通過轉(zhuǎn)染RXR表達(dá)載體進(jìn)CV-1細(xì)胞,篩選得到的一個穩(wěn)定高表達(dá)RXR蛋白的細(xì)胞系,通過在該細(xì)胞系上進(jìn)行MTT檢測來研究藥物對細(xì)胞的生長抑制作用與RXR蛋白的關(guān)系。同樣用3H標(biāo)記的9-cis確認(rèn)了SK02與R

4、XR的結(jié)合能力后,還采用糜蛋白酶酶切被SK02處理前后的重組RXR-LBD,觀察其LBD區(qū)域是否會因為其結(jié)合而發(fā)生構(gòu)型變化,表現(xiàn)在Western Blot上條帶的變化。為進(jìn)一步研究藥物的作用機(jī)制,我們采用氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶報告基因分析(CAT assay)考查靶標(biāo)藥物對RXR蛋白的同源轉(zhuǎn)錄激活以及和TR3,RAR的異源轉(zhuǎn)錄激活作用:同時用RXRα的表達(dá)載體和含RXRα結(jié)合位點的CAT報告基因(TREpal)轉(zhuǎn)染CV1細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后分別用不同

5、濃度的SK02和RXRα的特異性配體SR11237處理24小時,CAT分析檢測RXRα的轉(zhuǎn)錄效率；同樣的在異源轉(zhuǎn)錄活性檢測中,同時用RXRα的表達(dá)載體,表達(dá)RAR或者TR3的載體。和含RXRα結(jié)合位點的CAT報告基因(TREpal)轉(zhuǎn)染CV1細(xì)胞,3H標(biāo)記的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的cpm除以考查轉(zhuǎn)染效率的β-gal值,即是藥物影響下的轉(zhuǎn)錄效率。
　　 結(jié)果:我們發(fā)現(xiàn)1紫草粗提物能有效抑制肺癌細(xì)胞H460的生長,而同時加入9-

6、cis-RA(RXR的天然配體)減弱了這種生長抑制作用；2配體親和實驗表明紫草粗提物中含有可與RXR結(jié)合的成分,在1 ug/ml的濃度下就能把半數(shù)結(jié)合上去的[3H]9-cis-RA競爭下來；3經(jīng)過不同濃度的紫草粗提物處理,H460中RXR的含量出現(xiàn)劑量依賴性的下降,說明其對細(xì)胞中RXR蛋白穩(wěn)定性的影響；4進(jìn)一步研究紫草中作用的主要成分之-SK02組分,發(fā)現(xiàn)其對穩(wěn)定高表達(dá)RXR蛋白的CV-1細(xì)胞系具有更強(qiáng)的抑制作用；5 SK02其能與9-

7、cis競爭性結(jié)合RXR,在10-6M～10-4M間結(jié)合能力逐漸增強(qiáng),小于10-6M結(jié)合能力進(jìn)入平臺期；6 SK02與RXR的結(jié)合引起RXR LBD結(jié)構(gòu)域的變化,使得其對糜蛋白酶的敏感性增強(qiáng)；7SK02亦能抑制RXR的同源二聚體轉(zhuǎn)錄激活,以及與RXR/TR3,RXR/RAR的異源二聚體轉(zhuǎn)錄激活作用；8 SK02亦能促進(jìn)RXR的降解。
　　 結(jié)論:紫草的抗癌作用是通過其活性成分與核受體RXR蛋白結(jié)合,抑制RXR的轉(zhuǎn)錄激活并促進(jìn)RXR