大黃復(fù)方及其有效成分治療慢性腎衰竭的臨床和機(jī)理研究.pdf

1、第一部分：大黃治療慢性腎衰竭的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)
　　目的:評(píng)價(jià)大黃治療慢性腎衰竭的有效性及安全性。
　　方法:計(jì)算機(jī)檢索中國(guó)生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)CBM、中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù)CNKI、維普期刊數(shù)據(jù)庫(kù)VIP、萬(wàn)方資源數(shù)據(jù)庫(kù)、EMBASE、MEDLINE、PUBMED、Cochrane圖書(shū)館中關(guān)于大黃治療慢性腎衰竭的隨機(jī)和半隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)，同時(shí)手工檢索相關(guān)期刊雜志，并由兩位研究者進(jìn)行獨(dú)立篩選和資料提取，按照改良Jadad評(píng)分量表評(píng)價(jià)所納入的

2、文獻(xiàn)質(zhì)量，應(yīng)用Revman5.3軟件進(jìn)行Meta分析。
　　結(jié)果:
　?。ㄒ唬┐簏S單方或含大黃的中藥復(fù)方口服治療CRF的系統(tǒng)評(píng)價(jià)
　　納入35篇文獻(xiàn)，共3060例患者，其中治療組1657例，對(duì)照組1403例。Meta分析結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，大黃單方或含大黃的中藥復(fù)方口服治療能降低CRF患者Scr[MD=-73.28，95％CI（-85.96，-60.60）];降低BUN[MD=-2.47，95％CI（-3.13，-

3、1.82）];升高CRF患者Ccr[MD=6.66，95％CI(2.93，10.40)];升高Hb[MD=9.31，95％CI(3.81，14.80)];升高Alb[MD=2.94，95％CI(1.75，4.13)];降低24 h尿蛋白定量(24 h UTP)[MD=-0.63，95％CI（-0.95，-0.30）];降低TG[MD=-0.53，95％CI（-0.73，-0.32）]和TC[MD=-1.01，95％CI(-1.44,-0

4、.58)];并且可以改善CRF患者癥狀和體征的總有效率[Peto OR=3.42，95％CI(2.84，4.12)];但對(duì)于減少ESRD的發(fā)生[Peto OR=0.57，95％CI為(0.19，1.75)]與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　?。ǘ┖簏S的中藥灌腸方治療CRF的系統(tǒng)評(píng)價(jià)
　　納入28篇文獻(xiàn)，共2278例患者，其中治療組1220例，對(duì)照組1058例。Meta分析結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，含大黃的中藥灌腸方治療能

5、降低CRF患者Scr[MD=-59.62,95％CI（-88.58,-30.67）];降低BUN[MD=-3.27,95％CI（-4.49，-2.05）];升高CRF患者Ccr[MD=3.95，95％CI（-0.03，7.93）];改善CRF患者癥狀和體征的總有效率[Peto OR=4.08，95％CI(3.25，5.12)];并且可以改善中醫(yī)主要證候納差[MD=-0.48，95％CI（-0.77，-0.19）]和惡心嘔吐[MD=-0.

6、65，95％CI（-0.78，-0.52）];但對(duì)于升高Hb[MD=6.85，95％CI（-1.82，15.52）]、降低尿酸(UA)[MD=-46.84，95％CI（-102.91，9.22）]與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:與對(duì)照組相比，大黃單方或含大黃的中藥復(fù)方口服和含大黃的中藥灌腸方均能明顯降低CRF患者Scr、BUN，升高Ccr，同時(shí)還能改善患者癥狀和體征的總有效率，大黃單方或含大黃的中藥復(fù)方口服能升高Hb、

7、Alb，降低24h UTP、TG和TC，但無(wú)證據(jù)顯示在減少ESRD的發(fā)生方面較對(duì)照組更為有效;另外，含大黃的中藥灌腸方能改善中醫(yī)主要證候納差和惡心嘔吐，但對(duì)于升高Hb和降低UA無(wú)證據(jù)顯示較對(duì)照組更為有效，表明大黃可能是一種相對(duì)安全和有效治療CRF的藥物。但由于所納入的文獻(xiàn)存在研究方法學(xué)質(zhì)量低下的問(wèn)題，因此進(jìn)一步進(jìn)行高質(zhì)量文獻(xiàn)研究，對(duì)評(píng)價(jià)其療效及安全性十分必要。
　　第二部分：大黃素通過(guò)自噬途徑對(duì)腎小管損傷的保護(hù)機(jī)制研究
　　

8、背景及目的：
　　腎毒性的藥物所致的急性腎功能衰竭早已成為臨床醫(yī)生關(guān)注的重點(diǎn)，順鉑是一種臨床常用于治療多種惡性腫瘤的廣譜、有效的化療藥物，然而，據(jù)統(tǒng)計(jì)，臨床上運(yùn)用順鉑化療后，導(dǎo)致的腎損害發(fā)生率為25％-35％，且順鉑用藥劑量與其引起的腎臟毒性成一定的比例關(guān)系，已成為限制其用量及擴(kuò)大其應(yīng)用范圍的主要考慮因素。西藥在治療腎毒性藥物所致腎損傷的同時(shí)會(huì)帶來(lái)過(guò)多的不良反應(yīng)，因此，研究人員致力于尋找一種既能降低順鉑腎毒性，又能保留其抗癌活性的

9、中藥。自噬（autophagy），即溶酶體依賴(lài)性的大分子蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的自我降解，通過(guò)清除衰老的細(xì)胞器和長(zhǎng)壽命蛋白質(zhì)，為細(xì)胞修復(fù)提供原料與營(yíng)養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞器更新。細(xì)胞凋亡，是機(jī)體為了保持恒定的細(xì)胞數(shù)目而采取的由基因調(diào)控、生物自主的程序化方式。腎毒性的藥物損傷腎小管主要表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞的凋亡，越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道，在順鉑導(dǎo)致的腎臟細(xì)胞凋亡過(guò)程中，自噬發(fā)生在凋亡之前，其可能成為其抗凋亡的機(jī)制。
　　大黃素是中藥大黃的主要的藥效成分

10、，大量的研究表明其具有保護(hù)腎臟的作用，主要集中在抗炎，抑制增殖，抑制細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，以及抗氧化等方面。已有研究報(bào)道大黃素能改善順鉑相關(guān)性腎毒性，然而，目前還沒(méi)有研究報(bào)道大黃素是否可以通過(guò)自噬途徑改善順鉑引起的腎損傷。但有研究報(bào)道，大黃素是一種有效的單磷酸腺苷(AMP)激活蛋白激酶(AMPK)活化劑，并且可以調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物的雷帕霉素靶蛋白(mTOR)途徑。由于AMPK/mTOR信號(hào)通路在細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)中起著重要的作用，因此，我們推測(cè)，在順鉑腎

11、損傷中，大黃素是否有可能通過(guò)調(diào)節(jié)自噬而起到腎保護(hù)作用。
　　我們選用NRK-52E細(xì)胞作為研究對(duì)象，借助順鉑誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞損傷模型，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究，觀察大黃素對(duì)順鉑環(huán)境下細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的變化、自噬體形成情況，以及自噬相關(guān)信號(hào)通路的影響，進(jìn)一步探討自噬在腎毒性藥物所致的腎損傷中的變化和大黃素的干預(yù)作用，試圖在體外闡明大黃素通過(guò)調(diào)節(jié)自噬相關(guān)信號(hào)通路，改善腎毒性藥物所致的腎損傷的分子機(jī)制，為大黃素的臨床應(yīng)用提供新的途徑。<

12、br>　　方法：
　　首先，我們觀察了順鉑處理的NRK-52E細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞凋亡相關(guān)的標(biāo)志物表達(dá)情況。然后用順鉑加或不加大黃素處理NRK-52E細(xì)胞，用顯微進(jìn)行觀察，并且采用免疫印跡(Western Blot，WB)方法，檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、cleavedCaspase-3和哺乳動(dòng)物同源的自噬標(biāo)記蛋白-微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)Ⅰ/Ⅱ表達(dá)的情況，以及采用pmRFP-LC3轉(zhuǎn)染技術(shù)，利用熒光顯微鏡觀察了大黃素

13、處理細(xì)胞后自噬顆粒在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和分布情況。
　　其次，我們也應(yīng)用自噬體-溶酶體結(jié)合的抑制劑巴弗洛霉素A1，觀察其加入前后對(duì)大黃素誘導(dǎo)的自噬的影響。此外，雷帕霉素，哺乳動(dòng)物的雷帕霉素mTOR靶蛋白的抑制劑，在應(yīng)激條件下可以通過(guò)抑制mTOR活性而激活自噬，我們利用免疫印跡，顯微鏡觀察和流式細(xì)胞儀檢測(cè)等方法觀察了順鉑和雷帕霉素處理的細(xì)胞形態(tài)變化和細(xì)胞凋亡情況。
　　再次，進(jìn)一步觀察了大黃素通過(guò)調(diào)節(jié)AMPK/mTOR信號(hào)通路對(duì)自噬

14、活化的影響。采用WB的方法檢測(cè)了大黃素處理細(xì)胞后AMPK/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，與此同時(shí)，我們也在大黃素處理的細(xì)胞中加或不加compound C，一個(gè)公認(rèn)的AMPK抑制劑，觀察NRK-52E細(xì)胞形態(tài)和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　最后，除了上述通路的研究外，我們還觀察了MAPKs家族，包括ERK、P38和JNK所介導(dǎo)的信號(hào)通路，是否也參與了大黃素誘導(dǎo)的自噬活化。采用WB方法，檢測(cè)了大黃素不同時(shí)間點(diǎn)處理細(xì)胞后p-ERK、p

15、-P38和p-JNK蛋白的表達(dá)情況，以及LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的表達(dá)情況。同時(shí)，我們還分別選用了ERK和p38的抑制劑PD098059和SB203580，用大黃素加或不加PD098059和SB203580處理細(xì)胞，觀察p-ERK蛋白、p-p38蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　(1)隨著順鉑用藥時(shí)間和劑量的增加，觀察到細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，WB結(jié)果顯示，早期自噬標(biāo)志性蛋白LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的表達(dá)增加，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值

16、增加，晚期凋亡相關(guān)蛋白cleaved Caspase-3的表達(dá)增加，CCK-8法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果與WB的結(jié)果一致，晚期凋亡增加。
　　(2)順鉑處理組存活細(xì)胞數(shù)目減少，經(jīng)大黃素干預(yù)后，存活細(xì)胞數(shù)目明顯增多。免疫印跡處理后，表明大黃素與順鉑共同處理細(xì)胞，能夠明顯逆轉(zhuǎn)單獨(dú)順鉑處理細(xì)胞所致的cleaved Caspase-3蛋白的上調(diào)。同時(shí)，大黃素處理細(xì)胞，能夠明顯增加LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值和自噬顆粒RFP-LC3點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)的表達(dá)。我們

17、選用雷帕霉素處理細(xì)胞，同樣觀察到其可以增加LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的表達(dá)，增加LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值，倒置顯微鏡下觀察到在順鉑和大黃素共同處理細(xì)胞時(shí)加入巴佛洛霉素A1，凋亡細(xì)胞數(shù)反而明顯增加。此外，大黃素還能以時(shí)間依賴(lài)性的方式下調(diào)p-p70S6K蛋白和p-mTOR蛋白的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)p-AMPK蛋白的表達(dá)。WB結(jié)果表明，AMPK的抑制劑compound C能夠明顯的抑制大黃素誘導(dǎo)的AMPK的磷酸化，LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化也被明

18、顯的抑制，熒光顯微鏡觀察的結(jié)果與WB結(jié)果相同，加入了compound C之后，大黃素誘導(dǎo)的紅色熒光自噬顆粒明顯減少。倒置顯微鏡下觀察也發(fā)現(xiàn)compound C能明顯的抑制大黃素的抗凋亡作用，WB結(jié)果同樣表明，大黃素能明顯下調(diào)順鉑誘導(dǎo)的cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá)，但當(dāng)加入compound C共處理之后，又上調(diào)了cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá)。
　　(3) WB處理結(jié)果表明，大黃素處理細(xì)胞，p-ERK、

19、p-P38和p-JNK蛋白的表達(dá)水平隨著時(shí)間的變化先增加后降低;當(dāng)加入ERK的抑制劑PD098059和p38的抑制劑SB203580后，大黃素引起的p-ERK蛋白、p-p38蛋白的增加被抑制。
　　結(jié)論：
　　我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)順鉑處理NRK-52E細(xì)胞早期可以出現(xiàn)自噬，晚期則出現(xiàn)凋亡。大黃素能誘導(dǎo)自噬，進(jìn)而達(dá)到改善順鉑導(dǎo)致的NRK-52E細(xì)胞凋亡的作用。我們的機(jī)制研究結(jié)果提示，AMPK/mTOR信號(hào)通路和MAPKs家族成員

20、介導(dǎo)的信號(hào)通路可能參與了大黃素誘導(dǎo)自噬的過(guò)程。
　　第三部分：“益腎清利、和絡(luò)泄?jié)岱訙p大黃”辨證方延緩慢性腎衰竭進(jìn)展的臨床療效觀察
　　目的:評(píng)價(jià)“益腎清利、和絡(luò)泄?jié)岱訙p大黃”辨證方延緩CRF患者腎功能進(jìn)展的有效性。
　　方法:采用回顧性的研究方法，選擇2013年9月-2015年9月就診于江蘇省中醫(yī)院腎內(nèi)科導(dǎo)師孫偉教授門(mén)診，診斷為慢性腎衰竭的51例患者，觀察“益腎清利、和絡(luò)泄?jié)岱訙p大黃”辨證方治療后，臨床癥狀和療

21、效指標(biāo)的變化，總療程為2年，其中每位患者大黃連續(xù)或間斷用藥療程≥1個(gè)月。
　　結(jié)果:51例患者經(jīng)“益腎清利、和絡(luò)泄?jié)岱訙p大黃”辨證方治療24個(gè)月后，中醫(yī)臨床癥狀積分較初診時(shí)相比顯著下降(P＜0.01)。經(jīng)治療患者的主要療效指標(biāo)Scr、BUN、UA較治療前相比，均有所下降，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。治療前后相比較，RBC有所上升，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，治療后Hb輕微上升，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);治療