HIV-1 gag基因在人精子基因組中的整合及在早期胚胎細胞中的復(fù)制與表達.pdf

1、目的：構(gòu)建重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-gag，將其轉(zhuǎn)染人精子，與金黃地鼠去透明帶卵母細胞受精后，檢測HIV-1gag基因在人精子染色體上的整合與在早期胚胎細胞中的復(fù)制和表達，為HIV-1基因能否在父嬰間垂直傳遞提供直接的實驗證據(jù)。
　　 方法：⑴pIRES2-EGFP質(zhì)粒；⑵ΔNRF 逆轉(zhuǎn)率病毒質(zhì)粒；⑶人臍帶間充質(zhì)干細胞；⑷精子，取自健康男性自愿者；⑸卵母細胞，取自成熟雌性金黃地鼠。⑹pIRES2-EGFP-gag質(zhì)粒構(gòu)建，

2、用酶切、PCR 和基因測序3 種方法鑒定重組質(zhì)粒是否構(gòu)建成功；⑺細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染，觀察綠色熒光蛋白的表達，檢測pIRES2-EGFP-gag 質(zhì)粒能否在真核細胞中表達；⑻人精子與金黃地鼠去透明帶卵母細胞異種體外受精，獲取受精卵和2-細胞胚胎；⑼熒光原位雜交（FISH），檢測HIV-1 gag 基因是否在人精子、受精卵雄原核上整合及在胚胎細胞中復(fù)制；⑽RT-PCR，檢測HIV-1 gag 基因是否在人精子、胚胎細胞中轉(zhuǎn)錄；⑾免疫熒光技術(shù)，檢

3、測HIV-1 gag基因是否在人精子、胚胎細胞中翻譯。
　　 結(jié)果：①質(zhì)粒經(jīng)EcoRI和BamHI分別單酶切及EcoRI 和BamHI雙酶切，PCR和測序證實pIRES2-EGFP-gag質(zhì)粒構(gòu)建成功；②質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體包裹后轉(zhuǎn)染人臍帶間充質(zhì)干細胞，可見綠色熒光蛋白持續(xù)表達，表明構(gòu)建的pIRES2-EGFP-gag質(zhì)粒能在真核細胞中表達；③人精子與金黃地鼠去透明帶卵母細胞異種體外受精，成功地獲取了用于實驗的受精卵和2-細胞胚胎；④F

4、ISH：在人精子頭部、人精子染色體，受精卵雄原核和2-細胞胚兩個間期核上均觀察到HIV-1 gag DNA陽性雜交信號；⑤RT-PCR：在經(jīng)pIRES2-EGFP-gag轉(zhuǎn)染的人精子及其與金黃地鼠去透明帶卵母細胞受精后所得的胚胎樣本中，觀察到HIV-1 gag基因陽性帶；⑥免疫熒光檢測：在經(jīng)pIRES2-EGFP-gag轉(zhuǎn)染的人精子樣本中未觀察到HIV-1 gag p24蛋白的陽性信號，但在其與金黃地鼠去透明帶卵母細胞受精后所得的胚胎樣

5、本中，觀察到HIV-1 gag p24 蛋白的陽性信號。
　　 結(jié)論：⑴成功地構(gòu)建了重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-gag；⑵pIRES2-EGFP-gag質(zhì)?？梢栽谡婧思毎斜磉_；⑶HIV-1 gag基因能通過精子膜進入精子細胞并能整合到精子基因組內(nèi)；⑷攜帶HIV-1 gag基因的人精子可以完成正常受精過程；⑸精子介導(dǎo)的HIV-1 gag基因在早期細胞中與宿主基因組同步復(fù)制并通過卵裂進入子細胞；⑹HIV-1 gag基因可在人精