HIV-1 gag基因經(jīng)卵母細(xì)胞垂直傳遞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景與意義：自從1983年，當(dāng)首例由人類免疫缺陷病毒（HIV）引起的艾滋病被確診后，該病毒以驚人速度傳播。一般認(rèn)為，由病毒本身或其他途徑破壞機(jī)體免疫應(yīng)答是致病的重要原因。Bagasra 等從HIV 感染的臨床各期病人收集精樣，在較高比例（45％）的精子中，檢測到HIV-1 型前病毒DNA 序列。Baccetti 等運(yùn)用免疫化學(xué)、PCR 及電鏡水平的原位分子雜交技術(shù)，證實(shí)HIV-1 能與正常精子結(jié)合并進(jìn)入其中。該研究還在HIV-1 感

2、染的病人精樣中檢測到病毒顆粒、病毒抗原和病毒核酸，這些精子能將HIV-1 樣顆粒通過受精帶到正常的人卵母細(xì)胞內(nèi)。這些研究結(jié)果提示可能存在HIV 通過生殖細(xì)胞垂直傳遞的新途徑。要證實(shí)這一假設(shè)，必須首先證實(shí)HIV-1 基因能夠整合到宿主生殖細(xì)胞的基因組中；其次要證實(shí)由精子或卵子帶到胚胎細(xì)胞中的HIV-1 基因能夠復(fù)制和表達(dá)。因?yàn)镠IV-1 gag 基因編碼的結(jié)構(gòu)蛋白為新病毒顆粒形成所必需，而后者在HIV 的致病機(jī)制中起重要作用，因此本研究對(duì)

3、HIV-1 gag 基因在小鼠卵母細(xì)胞中的整合、轉(zhuǎn)錄和翻譯以及它被卵母細(xì)胞通過受精帶進(jìn)胚胎細(xì)胞后的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，目的在于為HIV-1 gag 基因通過雌（女）性生殖細(xì)胞垂直傳遞提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
　　 材料與方法：重組質(zhì)粒pIRES2 -EGFP-gag 由本室構(gòu)建。通過將其注射到小鼠卵巢轉(zhuǎn)染生殖細(xì)胞來探討HIV-1 gag 基因經(jīng)卵母細(xì)胞垂直傳遞的可能性。應(yīng)用超排獲得實(shí)驗(yàn)用卵母細(xì)胞，胚胎細(xì)胞則通過經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染卵巢

4、的雌鼠與正常雄鼠交配獲得。收集顯示綠色熒光的卵母細(xì)胞和胚胎，用熒光原位雜交（FISH）技術(shù)檢測HIV-1 gag 基因在未成熟卵母細(xì)胞間期核和成熟卵母細(xì)胞染色體上的整合以及胚胎細(xì)胞中的復(fù)制；用RT-PCR 檢測HIV-1 gag基因在卵母細(xì)胞與胚胎細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄；用免疫熒光技術(shù)檢測HIV-1 gag 基因在卵母細(xì)胞與胚胎細(xì)胞中的翻譯。
　　 結(jié)果：①重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-gag 含有HIV-1 gag 前病毒DNA 與綠

5、色熒光蛋白基因，后者編碼的綠色熒光蛋白可作為病毒基因表達(dá)的標(biāo)記，通過觀察是否顯示綠色熒光，很容易鑒別卵母細(xì)胞或胚胎是否含有病毒基因；② PCR 在顯示綠色熒光的卵母細(xì)胞中檢測到HIV-1 gag 基因特異的陽性帶；③ FISH 在未成熟卵母細(xì)胞的間期核和成熟卵母細(xì)胞的染色體上以及2-細(xì)胞胚胎的兩個(gè)子細(xì)胞核上均檢測到HIV-1 gag DNA 的陽性信號(hào)；④ RT-PCR在未成熟和成熟卵母細(xì)胞以及2-細(xì)胞胚胎中均檢測到HIV-1 gag

6、cDNA 陽性條帶；⑤免疫熒光在未成熟和成熟卵母細(xì)胞以及2-細(xì)胞胚胎的細(xì)胞質(zhì)中檢測到HIV-1 p24 gag 蛋白的陽性信號(hào)。
　　 結(jié)論：① pIRES2-EGFP-gag 質(zhì)粒的應(yīng)用使我們很容易地選定那些含有病毒基因的卵母細(xì)胞和胚胎，節(jié)省了時(shí)間和費(fèi)用并使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為準(zhǔn)確可靠；② HIV-1 gag 基因能夠通過卵透明帶和細(xì)胞膜并整合到卵母細(xì)胞基因組內(nèi)；③攜帶HIV-1 gag 基因的卵母細(xì)胞能完成正常的受精過程；④卵母細(xì)胞

7、介導(dǎo)的HIV-1 gag 基因在早期胚胎細(xì)胞中與宿主基因組同步復(fù)制并通過卵裂進(jìn)入子細(xì)胞；⑤整合到卵母細(xì)胞基因組或由卵帶入胚胎中的HIV-1 gag 基因能在未成熟與成熟卵母細(xì)胞以及胚胎細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄mRNA；⑥整合到卵母細(xì)胞基因組或由卵帶入胚胎中的HIV-1 gag 基因能在未成熟與成熟卵母細(xì)胞以及胚胎細(xì)胞中翻譯HIV-1p24 gag 蛋白；⑦本研究為HIV-1 gag 基因可經(jīng)過雌性生殖細(xì)胞垂直傳遞給子代提供了直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)；⑧本課題是