HIV-1 gag基因經(jīng)卵母細胞垂直傳遞的實驗研究.pdf

1、研究背景與意義：自從1983年，當首例由人類免疫缺陷病毒（HIV）引起的艾滋病被確診后，該病毒以驚人速度傳播。一般認為，由病毒本身或其他途徑破壞機體免疫應答是致病的重要原因。Bagasra 等從HIV 感染的臨床各期病人收集精樣，在較高比例（45％）的精子中，檢測到HIV-1 型前病毒DNA 序列。Baccetti 等運用免疫化學、PCR 及電鏡水平的原位分子雜交技術(shù)，證實HIV-1 能與正常精子結(jié)合并進入其中。該研究還在HIV-1 感

2、染的病人精樣中檢測到病毒顆粒、病毒抗原和病毒核酸，這些精子能將HIV-1 樣顆粒通過受精帶到正常的人卵母細胞內(nèi)。這些研究結(jié)果提示可能存在HIV 通過生殖細胞垂直傳遞的新途徑。要證實這一假設(shè)，必須首先證實HIV-1 基因能夠整合到宿主生殖細胞的基因組中；其次要證實由精子或卵子帶到胚胎細胞中的HIV-1 基因能夠復制和表達。因為HIV-1 gag 基因編碼的結(jié)構(gòu)蛋白為新病毒顆粒形成所必需，而后者在HIV 的致病機制中起重要作用，因此本研究對

3、HIV-1 gag 基因在小鼠卵母細胞中的整合、轉(zhuǎn)錄和翻譯以及它被卵母細胞通過受精帶進胚胎細胞后的復制、轉(zhuǎn)錄和翻譯進行了系統(tǒng)的研究，目的在于為HIV-1 gag 基因通過雌（女）性生殖細胞垂直傳遞提供實驗證據(jù)。
　　 材料與方法：重組質(zhì)粒pIRES2 -EGFP-gag 由本室構(gòu)建。通過將其注射到小鼠卵巢轉(zhuǎn)染生殖細胞來探討HIV-1 gag 基因經(jīng)卵母細胞垂直傳遞的可能性。應用超排獲得實驗用卵母細胞，胚胎細胞則通過經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染卵巢

4、的雌鼠與正常雄鼠交配獲得。收集顯示綠色熒光的卵母細胞和胚胎，用熒光原位雜交（FISH）技術(shù)檢測HIV-1 gag 基因在未成熟卵母細胞間期核和成熟卵母細胞染色體上的整合以及胚胎細胞中的復制；用RT-PCR 檢測HIV-1 gag基因在卵母細胞與胚胎細胞中的轉(zhuǎn)錄；用免疫熒光技術(shù)檢測HIV-1 gag 基因在卵母細胞與胚胎細胞中的翻譯。
　　 結(jié)果：①重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-gag 含有HIV-1 gag 前病毒DNA 與綠

5、色熒光蛋白基因，后者編碼的綠色熒光蛋白可作為病毒基因表達的標記，通過觀察是否顯示綠色熒光，很容易鑒別卵母細胞或胚胎是否含有病毒基因；② PCR 在顯示綠色熒光的卵母細胞中檢測到HIV-1 gag 基因特異的陽性帶；③ FISH 在未成熟卵母細胞的間期核和成熟卵母細胞的染色體上以及2-細胞胚胎的兩個子細胞核上均檢測到HIV-1 gag DNA 的陽性信號；④ RT-PCR在未成熟和成熟卵母細胞以及2-細胞胚胎中均檢測到HIV-1 gag

6、cDNA 陽性條帶；⑤免疫熒光在未成熟和成熟卵母細胞以及2-細胞胚胎的細胞質(zhì)中檢測到HIV-1 p24 gag 蛋白的陽性信號。
　　 結(jié)論：① pIRES2-EGFP-gag 質(zhì)粒的應用使我們很容易地選定那些含有病毒基因的卵母細胞和胚胎，節(jié)省了時間和費用并使實驗結(jié)果更為準確可靠；② HIV-1 gag 基因能夠通過卵透明帶和細胞膜并整合到卵母細胞基因組內(nèi)；③攜帶HIV-1 gag 基因的卵母細胞能完成正常的受精過程；④卵母細胞

7、介導的HIV-1 gag 基因在早期胚胎細胞中與宿主基因組同步復制并通過卵裂進入子細胞；⑤整合到卵母細胞基因組或由卵帶入胚胎中的HIV-1 gag 基因能在未成熟與成熟卵母細胞以及胚胎細胞中轉(zhuǎn)錄mRNA；⑥整合到卵母細胞基因組或由卵帶入胚胎中的HIV-1 gag 基因能在未成熟與成熟卵母細胞以及胚胎細胞中翻譯HIV-1p24 gag 蛋白；⑦本研究為HIV-1 gag 基因可經(jīng)過雌性生殖細胞垂直傳遞給子代提供了直接的實驗證據(jù)；⑧本課題是