祛毒養(yǎng)心沖劑對(duì)病毒性心肌炎療效及機(jī)制的研究.pdf

1、目的： 病毒性心肌炎(Viral myocarditis，VMC)是由病毒感染心臟引起的以心肌細(xì)胞變性、壞死及間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤和纖維化為主要病理改變的一種疾病。近年來VMC的發(fā)病率有逐年增高的趨勢(shì)。流行病學(xué)和分子生物學(xué)研究資料表明，腸道病毒(Enterovirus，EV)尤其是柯薩奇B3病毒(Coxsackievirus B3，CVB3)是引起VMC的最為常見的病原體。約50％以上的VMC是因感染CVB3所致。迄今為止，對(duì)VMC

2、疾病的發(fā)病機(jī)制尚缺乏深入的了解，臨床亦無有效的治療藥物。目前研究發(fā)現(xiàn)病毒的復(fù)制、炎性介質(zhì)及免疫誘導(dǎo)損傷等因素均參與了VMC的發(fā)生發(fā)展，且與VMC的預(yù)后密切相關(guān)。細(xì)胞因子(Cytokine，CK)是一類重要的免疫活性介質(zhì)，在病毒誘發(fā)的炎癥至感染后自身免疫反應(yīng)的產(chǎn)生及進(jìn)展過程中，起著十分重要的作用。其表達(dá)的多少與VMC心肌的病理改變及預(yù)后情況密切相關(guān)。心肌間質(zhì)的異常與心室重構(gòu)心功能不全的發(fā)生密切相關(guān)。CVB3誘導(dǎo)的心肌炎存在心室重構(gòu)?；|(zhì)金

3、屬蛋白酶(Matrix Ⅲetal.10proteinase，MMPs)及其組織抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMPs)系統(tǒng)與心室的重構(gòu)密切相關(guān)。MMPs/TIMPs是降解心肌細(xì)胞外基質(zhì)的重要成員，其活性增高或比例失調(diào)可導(dǎo)致正常的膠原蛋白被降解，心肌被缺乏纖維結(jié)構(gòu)的組織取代，引起心肌組織重塑、心腔擴(kuò)大、室壁變薄，導(dǎo)致心功能的衰竭。 本課題通過建立急性病毒性心肌炎的動(dòng)物模型

4、，研究病毒性心肌炎時(shí)心肌組織的病理改變，心肌組織中細(xì)胞因子IL-6及MMPs/TIMPs表達(dá)的情況，并用藥物祛毒養(yǎng)心沖劑進(jìn)行干預(yù)，觀察其對(duì)VMC小鼠生存狀況，心肌病理改變，病毒滴度，及對(duì)IL-6和MMPs/TIMPs表達(dá)的影響，為臨床治療VMC提供有力的理論依據(jù)。方法1.BALB/c雄性小鼠腹腔注射CVB3病毒建立病毒性心肌炎的動(dòng)物模型，留取心肌標(biāo)本行組織切片HE染色，并進(jìn)行組織病理學(xué)鑒定，同時(shí)應(yīng)用藥物祛毒養(yǎng)心沖劑進(jìn)行干預(yù)，觀察藥物對(duì)C

5、VB3感染小鼠的整體狀態(tài)變化，心肌的病理改變及病毒滴度的影響，全面整體地評(píng)價(jià)祛毒養(yǎng)心沖劑對(duì)VMC小鼠的保護(hù)作用。 2.提取心肌組織，應(yīng)用及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組小鼠心肌組織中細(xì)胞因子IL-6mRNA的表達(dá)情況，通過測(cè)定循環(huán)閾值(Ct)顯示IL-6mRNA的表達(dá)量，以β-actin作為參照?；虮磉_(dá)的相對(duì)變化以RQ值表示。 3.應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)各組小鼠心肌組織中MMP-2、MMP-9、TIMe-1mRNA的表達(dá)

6、情況。 提取心肌總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察電泳結(jié)果并拍照、掃描。將凝膠電泳圖條帶密度進(jìn)行計(jì)算機(jī)分析，計(jì)算電泳條帶與β-actin擴(kuò)增條帶光密度值作為其相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。 4.免疫組化技術(shù)分別檢測(cè)急性VMC小鼠心肌組織IL-6、 MMP-2、MMP-9、TIMP-1蛋白的表達(dá)情況應(yīng)用Image-Pro Plus6.0軟件采取陽性區(qū)域累計(jì)光密度值(integrated optica

7、l density，IOD)對(duì)心肌蛋白表達(dá)進(jìn)行圖像分析。觀察VMc小鼠用藥前后心肌IL-6、 MMP-2、MMP-9、TIMP-1蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果： 1.小鼠的一般狀況的觀察正常對(duì)照組小鼠整個(gè)觀察過程中活動(dòng)良好，未見異常。急性VMC組小鼠出現(xiàn)精神萎靡、食欲下降、相互撕咬等現(xiàn)象。藥物組小鼠癥狀明顯輕于病毒組。 2.心肌病理改變及病理積分情況正常對(duì)照組小鼠心肌病理切片可見心肌細(xì)胞排列整齊，未見肌纖維溶解，空泡變性

8、及單核細(xì)胞浸潤。病毒感染組小鼠心肌出現(xiàn)不同程度的病理改變。小鼠心臟切片HE染色下可見心肌的變性壞死和大量的炎性細(xì)胞浸潤，心肌細(xì)胞排列紊亂，肌纖維溶解現(xiàn)象明顯。用藥后心肌組織炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象明顯減少，心肌細(xì)胞腫脹，心肌纖維溶解現(xiàn)象得到有效地改善。病理積分測(cè)定結(jié)果顯示，急性VMC組病理積分顯著高于正常對(duì)照組，用藥后心肌病理積分明顯下降，兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。 3.空斑實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，病毒感染急性期，心肌組織中的病毒滴度

9、明顯升高，應(yīng)用藥物治療后，病毒滴度下降，兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。 4.細(xì)胞因子IL-6mRNA及蛋白表達(dá)的情況實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示：正常對(duì)照組見少量的IL-6mRNA的表達(dá)，病毒性心肌炎組小鼠心肌組織中IL-6mRNA的表達(dá)較正常對(duì)照組表達(dá)明顯升高，用藥后心肌IL-6mRNA的表達(dá)較急性VMC組顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：正常對(duì)照組小鼠心肌細(xì)胞胞漿可見少量的棕黃色顆

10、粒，病毒性心肌炎組小鼠心肌細(xì)胞胞漿棕黃色顆粒較正常對(duì)照組表明顯增多(P<0.05)，用藥后心肌細(xì)胞棕黃色顆粒數(shù)目較急性VMC組顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 5.MMP-2、MMP-9、TIMP-1mRNA及蛋白表達(dá)的情況RT-PCR結(jié)果顯示：VMC組小鼠心肌組織中MMP-2、MMP-9mRNA的表達(dá)較正常對(duì)照組表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。TIMP-1mRNA的表達(dá)較正常對(duì)照組的表達(dá)變化無明顯差

11、異。用藥后心肌組織MMP-2、MMP-9mRNA的表達(dá)較急性VMC組明顯下降(P<0.05)，TIMP-1mRNA的表達(dá)無明顯變化(P>0.05)。 免疫組化結(jié)果顯示：VMC組小鼠心肌組織中MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)較正常對(duì)照組表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。TIMP-1蛋白的表達(dá)較正常對(duì)照組的表達(dá)變化無明顯差異。用藥后心肌組織MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)較急性VMC組明顯下降(P<0.05)，TIMP