硫酸小檗堿對(duì)仔豬IEC的TGF-β1基因表達(dá)影響的研究.pdf

1、仔豬腹瀉是困擾養(yǎng)豬業(yè)的主要疾病。多種腹瀉因素造成腸道黏膜損傷后的黏膜修復(fù)對(duì)發(fā)病仔豬的轉(zhuǎn)歸至關(guān)重要。腸黏膜修復(fù)相關(guān)因子，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)的基因表達(dá)決定受損腸黏膜的修復(fù)水平。為了探討硫酸小檗堿對(duì)損傷腸粘膜上皮細(xì)胞修復(fù)的作用，開(kāi)展了如下研究：
　　1.利用酶消化法培養(yǎng)仔豬腸黏膜上皮細(xì)胞(IEC)。通過(guò)對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的顯微形態(tài)觀察和CK-18角蛋白免疫組化鑒定，確定培養(yǎng)的細(xì)胞為仔豬腸黏膜上皮細(xì)胞。
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2、.利用MTT法篩選硫酸小檗堿對(duì)IEC的安全濃度，試驗(yàn)選擇5μ mol/L、10μmol/L、20μ mol/L、40μ mol/L、80μ mol/L等濃度下對(duì)IEC的影響，結(jié)果表明硫酸小檗堿對(duì)體外培養(yǎng)的IEC最大安全濃度為20μ mol/L，高于此濃度則表現(xiàn)細(xì)胞毒性，導(dǎo)致細(xì)胞壞死脫落，無(wú)法開(kāi)展藥效學(xué)研究。
　　3.利用豬輪狀病毒對(duì)仔豬IEC攻毒建立細(xì)胞損傷模型。本研究分別篩選不同劑量的輪狀病毒感染細(xì)胞，結(jié)果表明本試驗(yàn)用的豬輪狀病

3、毒TCID50是10-4.5/0.1mL。用0.2mL(126 TCID50)豬輪狀病毒對(duì)仔豬腸黏膜上皮細(xì)胞進(jìn)行攻毒，既可以損傷細(xì)胞，又不至于把細(xì)胞大量殺死，符合試驗(yàn)要求。
　　4.在建立輪狀病毒對(duì)IEC損傷模型基礎(chǔ)上，分攻毒前和攻毒后兩種時(shí)間點(diǎn)使用硫酸小檗堿進(jìn)行干預(yù)。試驗(yàn)一組先用豬輪狀病毒對(duì)IEC攻毒造成損傷，再用5μ mol/L、10μ mol/L、20μ mol/L三個(gè)濃度的硫酸小檗堿對(duì)受損的IEC用藥。試驗(yàn)二組是先向IEC

4、加入5μ mol/L、10μ mol/L、20μ mol/L三個(gè)濃度的硫酸小檗堿，作用一定時(shí)間后再對(duì)其攻毒造成損傷，同時(shí)設(shè)立第三組為對(duì)照組。對(duì)不同處理組的細(xì)胞提取總RNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定硫酸小檗堿對(duì)仔豬IEC中TGF-β1基因表達(dá)的影響。
　　用SPSS軟件對(duì)所得的結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，兩個(gè)試驗(yàn)組中5μ mol/L、10μ mol/L、20μ mol/L三個(gè)濃度的硫酸小檗堿均可以顯著提高IEC中TGF-β1mR