新巴貝西蟲(chóng)病的發(fā)現(xiàn)及其病原體鑒定.pdf

1、一．研究背景：
　　人巴貝西蟲(chóng)病，由頂復(fù)門（Apicomplexa）的巴貝西蟲(chóng)屬（Babesia）原蟲(chóng)引起的紅細(xì)胞內(nèi)寄生性原蟲(chóng)疾病，主要經(jīng)由攜帶巴貝西蟲(chóng)的媒介蜱叮咬傳播。1888年，匈牙利生物學(xué)家Victor Babes在一頭發(fā)熱并伴有血尿的牛外周血中發(fā)現(xiàn)巴貝西蟲(chóng)，并以他的名字命名了該病原體。自1957年克羅地亞報(bào)道第一例人感染巴貝西蟲(chóng)病以來(lái)，越來(lái)越多的巴貝西蟲(chóng)病例被發(fā)現(xiàn)。目前，人類已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過(guò)100種巴貝西蟲(chóng)可以感染野生動(dòng)物或家

2、畜，而其中只有近十種可以感染人類。巴貝西蟲(chóng)屬于自然疫源性疾病，具有區(qū)域性流行特點(diǎn)。在對(duì)人致病的巴貝西蟲(chóng)中，根據(jù)形態(tài)學(xué)特征結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育分析，可以概括為四類。代表種分別為：主要流行于美國(guó)絕大部分地區(qū)的微小巴貝西蟲(chóng)、引起美國(guó)散在病例的鄧肯巴貝西蟲(chóng)、流行于歐洲的分歧巴貝西蟲(chóng)及獵戶巴貝西蟲(chóng)，以及2007年韓國(guó)報(bào)道的一種大巴貝西蟲(chóng)（Babesia sp.“KO1”）。
　　我國(guó)相關(guān)研究報(bào)道了蜱及動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)多種巴貝西蟲(chóng)，但絕大多數(shù)尚未發(fā)現(xiàn)對(duì)人致

3、病的證據(jù)。國(guó)內(nèi)目前只有散在的人感染巴貝西蟲(chóng)病例報(bào)道,包括浙江云南等地12例微小巴貝西蟲(chóng)病例、山東2例分歧巴貝西蟲(chóng)病例、新疆1例獵戶巴貝西蟲(chóng)病例，以及山西、浙江及云南地區(qū)報(bào)道的14例未定種巴貝西蟲(chóng)感染病例。在這些病人中，有的病例復(fù)合感染了瘧疾等其他傳染病，重癥患者也不斷發(fā)生。巴貝西蟲(chóng)感染導(dǎo)致的疾病負(fù)擔(dān)與日俱增，已成為一種“新的健康威脅”，其公共衛(wèi)生重要性已越來(lái)越受到人們的關(guān)注。
　　目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于巴貝西蟲(chóng)病人的研究均為被動(dòng)的發(fā)現(xiàn)病例

4、，巴貝西蟲(chóng)病在臨床上遠(yuǎn)遠(yuǎn)還未被醫(yī)生所認(rèn)識(shí)和關(guān)注，經(jīng)常導(dǎo)致誤診、漏診。而且，在那些已經(jīng)發(fā)現(xiàn)人感染病例的地區(qū)，宿主和媒介中感染的優(yōu)勢(shì)種及其分布往往不太一致；尤其是在諸多媒介蜱和宿主中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)攜帶的一些巴貝西蟲(chóng)種，是否可以對(duì)人致病？國(guó)內(nèi)是否存在其他對(duì)人致病巴貝西蟲(chóng)？巴貝西蟲(chóng)流行區(qū)的優(yōu)勢(shì)基因型及其分布情況如何？巴貝西蟲(chóng)自然疫源地典型特征如何？等一系列問(wèn)題尚無(wú)系統(tǒng)研究，但亟待解決。由于全國(guó)層面的人群巴貝西蟲(chóng)流行病學(xué)調(diào)查短時(shí)間內(nèi)很難實(shí)現(xiàn)，所以，本研

5、究擬選擇有特征性的、蜱媒病復(fù)雜多樣的東北地區(qū)作為著眼點(diǎn)，針對(duì)當(dāng)?shù)仳缫эL(fēng)險(xiǎn)較大、從事農(nóng)業(yè)及林區(qū)作業(yè)的人群，依托哨點(diǎn)醫(yī)院，開(kāi)展人群巴貝西蟲(chóng)監(jiān)測(cè)。對(duì)我國(guó)巴貝西蟲(chóng)病認(rèn)識(shí)的提高和有效防控的實(shí)施，以及保護(hù)人民群眾健康具有非常重要的意義。
　　二、研究目的：
　　開(kāi)展基于哨點(diǎn)醫(yī)院的人巴貝西蟲(chóng)病的監(jiān)測(cè)，旨在弄清該地區(qū)人群巴貝西蟲(chóng)的流行情況以及優(yōu)勢(shì)流行株，了解其病原學(xué)特征，掌握病例臨床表現(xiàn)特點(diǎn)。同時(shí)，掌握當(dāng)?shù)孛浇轵?、宿主中巴貝西蟲(chóng)的流行特征，

6、了解疫源地特點(diǎn)，掌握傳播及感染風(fēng)險(xiǎn)，并以此為依據(jù)，評(píng)估當(dāng)?shù)匕拓愇飨x(chóng)對(duì)人群的威脅。
　　三、研究方法：
　　2011年至2015年，每年5月至7月開(kāi)展基于哨點(diǎn)醫(yī)院（黑龍江省牡丹江林業(yè)中心醫(yī)院）的巴貝西蟲(chóng)的主動(dòng)監(jiān)測(cè)，納入在過(guò)去兩個(gè)月內(nèi)被蜱叮咬的病人，并通過(guò)問(wèn)卷的形式來(lái)獲得病人人口學(xué)信息及流行病學(xué)信息。病人臨床信息則通過(guò)病案記錄進(jìn)行登記存檔。以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）對(duì)病人進(jìn)行初篩，并結(jié)合姬姆薩染色鏡檢，及聯(lián)合重癥免疫缺陷（SCI

7、D）小鼠接種分離病原體實(shí)驗(yàn)，確認(rèn)巴貝西蟲(chóng)感染，并且以原位熒光雜交（FISH）實(shí)驗(yàn)作為輔助診斷。通過(guò)18S rRNA基因序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析對(duì)巴貝西蟲(chóng)進(jìn)行定種。對(duì)于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)陽(yáng)性者，結(jié)合臨床表現(xiàn)，使用美國(guó)國(guó)家CDC制定的巴貝西蟲(chóng)診斷標(biāo)準(zhǔn)，區(qū)分確診病例和疑似病例。為探明相關(guān)細(xì)胞因子同巴貝西蟲(chóng)感染之間可能的關(guān)聯(lián)，對(duì)病例血清細(xì)胞因子進(jìn)行了檢測(cè)。同時(shí)，對(duì)牡丹江周邊林區(qū)的蜱及家畜中巴貝西蟲(chóng)進(jìn)行同步調(diào)查，采用18S rRNA基因比對(duì)的方法確定巴貝西

8、蟲(chóng)種。根據(jù)當(dāng)?shù)厮拗鲃?dòng)物、蜱中巴貝西蟲(chóng)流行情況評(píng)估巴貝西蟲(chóng)對(duì)當(dāng)?shù)厝巳旱耐{。
　　四、研究結(jié)果：
　　經(jīng)過(guò)2011年至2015年五年的研究，共收集到3454份蜱咬病人外周血樣本及病歷資料。首次發(fā)現(xiàn)了東北地區(qū)存在兩種巴貝西蟲(chóng)病流行，包括獵戶巴貝西蟲(chóng)及一種新巴貝西蟲(chóng)（“Babesia sp.MDJ”）。首先，在2011-2014年的第一研究階段，發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了世界上最大的一簇獵戶巴貝西蟲(chóng)病人，共48例。經(jīng)18S rRNA基因短片段比

9、對(duì)發(fā)現(xiàn)48例病例基因序列完全一致，并且同歐洲報(bào)道獵戶巴貝西蟲(chóng)完全一致，表現(xiàn)出在不同生態(tài)系統(tǒng)下獵戶巴貝西蟲(chóng)高度的保守性。18S rRNA基因全序比對(duì)也證明了這一點(diǎn)。姬姆薩染色鏡檢、原位熒光雜交實(shí)驗(yàn)及SCID小鼠接種分離病原體的方法進(jìn)一步證實(shí)了獵戶巴貝西蟲(chóng)感染。依據(jù)美國(guó)國(guó)家CDC制定的巴貝西蟲(chóng)診斷標(biāo)準(zhǔn)對(duì)48例病人進(jìn)行分類診斷，其中32名為確診病例，16例為疑似病例。在32例確診病例中，21例（66％）表現(xiàn)出發(fā)熱，13例（41%）伴有頭痛，1

10、2例（38%）伴有肌肉痛或者關(guān)節(jié)痛，而3例（9%）伴有寒戰(zhàn)。14例（44%）病人存在乏力，8名（25%）存在頭昏，8例（25%）存在嗜睡表現(xiàn)。6名（19%）存在蜱叮咬處紅斑，2位存在淋巴結(jié)腫大。分別有7位（22%）病人有貧血和4位（13%）血小板減少。14名確診病人中7名病例出現(xiàn)轉(zhuǎn)氨酶指標(biāo)升高。相對(duì)對(duì)照組，確診病例組的TNF-α（p＜0.001）及VCAM-1（p＜0.001）濃度均顯著性升高，而PECAM-1（p＜0.001）、P-s

11、electin（p＜0.001）及ICAM-3（p＜0.001）濃度均顯著性降低；疑似病例組的VCAM-1（p＜0.001）濃度顯著性升高，而PECAM-1（p＜0.001）及ICAM-3（P＜0.01）濃度均顯著性降低。
　　同時(shí)對(duì)牡丹江周邊林區(qū)開(kāi)展媒介蜱中巴貝西蟲(chóng)流行情況調(diào)查，發(fā)現(xiàn)牡丹江周邊林區(qū)媒介蜱中存在6種巴貝西蟲(chóng)。全溝硬蜱（Ixodes persulcatus）中總感染率為1.77%，并且可以攜帶5種巴貝西蟲(chóng)，分別為獵戶

12、巴貝西蟲(chóng)、分歧巴貝西蟲(chóng)、微小巴貝西蟲(chóng)、雙芽巴貝西蟲(chóng)（Babesia bigemina）及一種新巴貝西蟲(chóng)，我們暫時(shí)以牡丹江市首字母命名為“Babesia sp. MDJ”。嗜群血蜱（ Haemaphysalis concinna）中巴貝西蟲(chóng)總體感染率為2.17%，有三種巴貝西蟲(chóng)共存，除雙芽巴貝西蟲(chóng)及以上所述新巴貝西蟲(chóng)（“Babesia sp. MDJ”）外，還有一種未定種巴貝西蟲(chóng)，其與日本在浣熊中發(fā)現(xiàn)的巴貝西蟲(chóng)進(jìn)化地位相近。
　　針

13、對(duì)上述全溝硬蜱及嗜群血蜱中發(fā)現(xiàn)的新巴貝西蟲(chóng)（“Babesia sp. MDJ”），對(duì)2015年哨點(diǎn)醫(yī)院收集的542份蜱咬就診病人外周血樣進(jìn)行篩查。共發(fā)現(xiàn)49例病例感染了“Babesia sp.MDJ”。經(jīng)18S rRNA基因序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析，確認(rèn)該巴貝西蟲(chóng)是一種新的對(duì)人致病巴貝西蟲(chóng)，并通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察確認(rèn)“Babesia sp. MDJ”為一種大巴貝西蟲(chóng)。根據(jù)診斷標(biāo)準(zhǔn)，49例病例中的19例為確診病例，其余30例為疑似病例。平均年齡5

14、1歲（4-72），其中37例（63%）為女性。全部患者均有蜱咬史，最常見(jiàn)的叮咬部位是頭皮、耳朵及脖頸，也有少數(shù)叮咬于軀干及腹部。叮咬地點(diǎn)最常見(jiàn)的是林區(qū)，其次是農(nóng)田及庭院。頭暈（57.9%）、頭疼（52.6%）及惡心（52.6%）是最為常見(jiàn)的癥狀。另外，有7例（36.8%）病例出現(xiàn)發(fā)熱癥狀，有2例（10.5%）病例表現(xiàn)出肌痛。2例（10.5%）確診病例及4例（13.3%）疑似病例出現(xiàn)淋巴結(jié)腫大。在收集到42份血清樣本中，6例（14.3%）

15、病例的轉(zhuǎn)氨酶升高，而其中11例（26.2%）出現(xiàn)總膽紅素水平升高。在牡丹江周邊有針對(duì)性的對(duì)家畜中“Babesia sp. MDJ”感染情況進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果顯示461只綿羊中有5只“Babesia sp. MDJ”陽(yáng)性，并且基因序列比對(duì)顯示人、蜱及綿羊中發(fā)現(xiàn)的“Babesia sp. MDJ”18S rRNA基因序列一致，而山羊、牛及鹿均為陰性，提示綿羊可能為“Babesia sp. MDJ”在當(dāng)?shù)氐乃拗鲃?dòng)物，結(jié)合媒介蜱中巴貝西感染結(jié)果，確

16、認(rèn)了東北地區(qū)為“Babesia sp. MDJ”的自然疫源地。
　　五、研究結(jié)論：
　　發(fā)現(xiàn)了世界上最大的一簇獵戶巴貝西蟲(chóng)病例，并首次發(fā)現(xiàn)了一種新的可以對(duì)人致病的大巴貝西蟲(chóng)（“Babesia sp. MDJ”），并且兩種巴貝西蟲(chóng)均可以感染健康人群；確認(rèn)了東北地區(qū)是以上兩種巴貝西蟲(chóng)病的流行區(qū)；證實(shí)了當(dāng)?shù)仳缰邪拓愇飨x(chóng)多樣性及復(fù)雜性；初步確定了新巴貝西蟲(chóng)“Babesia sp. MDJ”在當(dāng)?shù)氐囊环N宿主動(dòng)物——綿羊；確認(rèn)了東北地區(qū)

17、獵戶巴貝西蟲(chóng)、“Babesia sp. MDJ”自然疫源地的存在。
　　六、意義與創(chuàng)新性：
　　在世界范圍內(nèi)報(bào)道了最大的獵戶巴貝西蟲(chóng)病例群，并且首次發(fā)現(xiàn)了一種全新的可以感染人體的大巴貝西蟲(chóng)（“Babesia sp. MDJ”），并首次發(fā)現(xiàn)以上兩種巴貝西蟲(chóng)可以感染健康人群，為進(jìn)一步研究巴貝西蟲(chóng)提供了重要依據(jù)。由于巴貝西蟲(chóng)病例常常表現(xiàn)出非特異性癥狀，所以在臨床診斷方面常引起誤診。另外，根據(jù)本研究以及相關(guān)文獻(xiàn)，可以認(rèn)為，在中國(guó)巴貝

18、西蟲(chóng)病分布應(yīng)當(dāng)非常廣泛，隨著巴貝西蟲(chóng)檢測(cè)方法的發(fā)展及推廣，那些先前被認(rèn)為對(duì)人體不致病的巴貝西蟲(chóng)可能在不遠(yuǎn)的未來(lái)被證明是可以感染人。所以本研究進(jìn)一步證實(shí)了巴貝西蟲(chóng)病遠(yuǎn)比人們想象的要普遍，這將有助于提高臨床醫(yī)生及公共衛(wèi)生工作人員、蜱叮咬暴露人群對(duì)于巴貝西蟲(chóng)病的重視。
　　本研究結(jié)果還證明了：巴貝西蟲(chóng)病不僅對(duì)免疫缺陷病人存在重要威脅，也同樣威脅著免疫健全者。由于一方面，巴貝西蟲(chóng)亞臨床病例及輕癥病例本身可能在接受脾臟切除手術(shù)、接受免疫抑制

19、藥物治療或罹患腫瘤等惡性疾病的情況下惡化為嚴(yán)重的甚至致命的巴貝西蟲(chóng)感染；另外一方面，亞臨床病例及輕癥感染者可能無(wú)意識(shí)的通過(guò)輸血將巴貝西蟲(chóng)傳染給受血者，由于需要輸血的病人往往已經(jīng)存在免疫低下或嚴(yán)重的基礎(chǔ)疾病，所以對(duì)受血者，輸血引起巴貝西蟲(chóng)感染往往后果更嚴(yán)重。本研究對(duì)于疫區(qū)的輸血安全和潛在威脅也提供了科學(xué)預(yù)警。
　　可以說(shuō)，本研究結(jié)果從巴貝西蟲(chóng)流行地域、癥狀多樣性、流行病學(xué)特、實(shí)驗(yàn)室特征、病原學(xué)等方面，加深了人們對(duì)巴貝西蟲(chóng)這種紅細(xì)胞內(nèi)