基于芳香烴受體系統(tǒng)的痕量二惡英生物檢測方法的研究.pdf

1、目的：采用分子生物和生物化學技術,依據芳香烴受體(AhR)在二惡英的活化作用下能與芳香烴受體核轉位蛋白(ARNT)特異性結合的分子機制。本課題旨在探索一種基于芳香烴受體系統(tǒng)的快速、簡便、經濟且特異性很強的二惡英生物檢測方法。
　　 方法：(1)以小鼠肝組織中提取的總RNA為模板,采用RT-PCR的方法擴增目的基因,DNA測序分析驗證后,利用pGEX-5X-1表達質粒,構建AhR和ARNT全長及相應片段AhR-PAS、AhR-C和

2、ARNT-PAS共5個蛋白的重組表達質粒。酶切鑒定后將重組質粒轉化入大腸桿菌BL21(DE3)的感受態(tài)細胞中,在該原核系統(tǒng)中大量表達目的蛋白質,采用谷光甘肽瓊脂糖凝膠(Glutathione SepharoseTM4B)親和層析純化GST-融合蛋白或利用凝血因子Xa對融合蛋白的進行酶切獲得目的蛋白質。(2)利用AhR-PAS和AhR-C這兩個特異性片段蛋白免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體。(3)從C57BL/6J純系小鼠肝組織中提取具有結

3、合活性的天然AhR,采用Bradford法對總蛋白進行定量,計算出其中AhR的含量。(4)將天然AhR與GST-ARNT、GST-ARNT-PAS以等摩爾的比例混合,在室溫下與不同劑量的TCDD進行溫育結合。將結合了的GST-ARNT-AhR復合物用Glutathione Scpha-roseTM4B珠子進行親和吸附,并用結合緩沖液洗去非特異性結合蛋白。最后采用免疫印跡(Western Blot)等方法,以AhR-PAS或AhR-C兩種

4、蛋白制得的多克隆抗體作為檢測所需的一抗,研究AhR與融合蛋白ARNT、ARNT-PAS結合的條件、程度及劑量反應關系,從而對TCDD進行定量分析。
　　 結果：(1)成功地克隆了目的基因并在原核系統(tǒng)中表達了相應蛋白；(2)免疫家兔獲得2種高效價的多克隆抗體,免疫印跡的檢測下限分別是1ng和5ng；(3)從C57BL/6J純系小鼠肝組織中提取出具有結合活性的天然AhR,其濃度為3-7.2pmol/mlcytosol；(4)克隆蛋白