內(nèi)外源性芳香烴類(lèi)化合物對(duì)芳香烴受體的誘導(dǎo)效應(yīng)研究.pdf

1、芳香烴類(lèi)化合物是自然界中廣泛存在的一類(lèi)對(duì)人體健康有重要影響的物質(zhì)。芳香烴受體(AhR)是配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，能夠被多種天然或化學(xué)合成的物質(zhì)激活，介導(dǎo)AhR配體的毒性效應(yīng)和生物學(xué)效應(yīng)。AhR的活性是由配體調(diào)節(jié)的，為了探究AhR對(duì)其配體的應(yīng)答，實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了兩株重組細(xì)胞株。選取多種內(nèi)外源性芳香烴化合物對(duì)重組細(xì)胞進(jìn)行刺激，探究不同來(lái)源的配體對(duì)AhR的誘導(dǎo)效應(yīng)。主要實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.重組細(xì)胞株Hepa1.6-pGl4.43和Hep

2、G2-pGl4.43的構(gòu)建及其穩(wěn)定株的篩選。實(shí)驗(yàn)利用質(zhì)粒pGl4.43[luc2P/XRE/Hygro]轉(zhuǎn)染鼠肝癌細(xì)胞Hepa1.6和人肝癌細(xì)胞HepG2，構(gòu)建了兩株受XRE應(yīng)答元調(diào)控的，以熒光素酶作為報(bào)告基因的重組細(xì)胞株，潮霉素B篩選濃度分別為800μg/mL和200μg/mL。結(jié)果證明，兩株重組細(xì)胞具有高靈敏性，較低濃度的TCDD(100 pM)、FICZ(10 nM)既能明顯引起熒光素酶的表達(dá)。
　　2.驗(yàn)證重組細(xì)胞對(duì)配體應(yīng)

3、答的準(zhǔn)確性。我們利用TCDD、FICZ刺激野生型鼠肝癌細(xì)胞Hepa1.6和人肝癌細(xì)胞HepG2，檢測(cè)細(xì)胞色素酶CYP A1，CYP1B1的表達(dá)量，結(jié)果與重組細(xì)胞株呈現(xiàn)相同的趨勢(shì)。因此，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了應(yīng)答芳香烴類(lèi)化合物的高靈敏細(xì)胞系，可以利用構(gòu)建的重組細(xì)胞系探究AhR對(duì)其配體的應(yīng)答。
　　3.探究AhR對(duì)其配體的應(yīng)答反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)利用構(gòu)建的重組細(xì)胞報(bào)告基因系統(tǒng)，篩選5種外源，7種食源，4種內(nèi)源性化合物，來(lái)確定他們對(duì)芳香烴受體的應(yīng)答。結(jié)

4、果顯示外源性配體和內(nèi)源性配體是AhR的激動(dòng)劑。大部分的食源性配體濃度較低時(shí)能夠激活A(yù)hR，是AhR弱激動(dòng)劑，但是在高濃度時(shí)，某些食源性配體具有抑制AhR的作用，是AhR拮抗劑。在重組鼠肝癌細(xì)胞的食源性配體與FICZ/TCDD共同作用實(shí)驗(yàn)證明，食源性配體協(xié)同F(xiàn)ICZ對(duì)AhR的作用;高濃度的3'，4'-DMF、QUE、RES、CUR抑制TCDD對(duì)AhR的作用，而API、DAI一直呈協(xié)同的趨勢(shì)。在重組人肝癌細(xì)胞的食源性配體與FICZ/TCDD

5、共同作用實(shí)驗(yàn)證明，低濃度的API、QUE、RES、CUR協(xié)同F(xiàn)ICZ/TCDD對(duì)AhR的作用而高濃度呈現(xiàn)拮抗趨勢(shì);而DAI、3'，4'-DMF一直呈協(xié)同的趨勢(shì)。
　　4.驗(yàn)證食源性配體對(duì)細(xì)胞活性的抑制。用MTT比色法評(píng)估野生型細(xì)胞活力的抑制發(fā)現(xiàn)，隨著濃度的升高，對(duì)細(xì)胞活性抑制率逐漸增大，并且對(duì)人肝癌細(xì)胞的毒性明顯大于鼠肝癌細(xì)胞。
　　構(gòu)建以熒光素酶為報(bào)告基因的重組細(xì)胞具有靈敏、簡(jiǎn)單、快速的特點(diǎn)，可以滿足本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)芳香烴受體介