重組人源性脂聯(lián)素球狀結(jié)構(gòu)的中試工藝及生物活性研究.pdf

1、心血管系統(tǒng)疾病是威脅人類生命健康的首敵,徹底闡明其發(fā)病機(jī)理并尋求相應(yīng)的治療措施,是當(dāng)今世界醫(yī)學(xué)界亟待攻克的一項重大課題。近年來的研究證明,以糖尿病為突出臨床特征的代謝綜合征是心血管疾病的“原兇”?？刂铺悄虿〖按x綜合征的藥物正成為心血管系統(tǒng)疾病防治的第一戰(zhàn)場。
　　脂聯(lián)素主要是由脂肪細(xì)胞合成和分泌的細(xì)胞因子,能夠調(diào)節(jié)糖脂代謝、抗炎癥、抗凋亡、抑制氧化/硝化反應(yīng),從而直接或者間接地保護(hù)心血管系統(tǒng)。肥胖、2型糖尿病患者血漿脂聯(lián)素下降,

2、其對心血管保護(hù)作用也減弱。研究表明,給予外源性脂聯(lián)素能夠改善糖尿病動物胰島素抵抗,降低血糖、血脂以及減輕動物的心肌缺血再灌注損傷,起到心臟保護(hù)作用。脂聯(lián)素強(qiáng)大的生物學(xué)作用,使其有望成為治療2型糖尿病和心血管疾病的候選藥物,但其大規(guī)模的生產(chǎn)仍是一個難題。
　　全長脂聯(lián)素包含4個結(jié)構(gòu)域:信號序列區(qū)、可變區(qū)、膠原樣區(qū)及球狀區(qū)(Globulardomainofadiponectin,gAd),人體正常血液中不僅存在全長型脂聯(lián)素,同時也存在

3、脂聯(lián)素球狀結(jié)構(gòu)(gAd);脂聯(lián)素球狀結(jié)構(gòu)在血液中的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于全長型脂聯(lián)素,但其降低血糖、改善胰島素抵抗以及增加脂肪酸氧化的能力要更強(qiáng)于全場型脂聯(lián)素。因此活性更強(qiáng)、用藥劑量更少的gAd成為大規(guī)模生產(chǎn)的目標(biāo)。
　　現(xiàn)階段使用的脂聯(lián)素球狀結(jié)構(gòu)(gAd)大多數(shù)來源于真核(酵母)以及哺乳動物細(xì)胞的表達(dá),其制備工藝復(fù)雜、產(chǎn)量低、成本高、耗費(fèi)時間長,極大地限制了其廣泛的臨床應(yīng)用。因此建立簡便、廉價的gAd制備工藝是其廣泛應(yīng)用于臨床的關(guān)鍵。

4、r>　　研究目的:
　　1.利用基因工程方法構(gòu)建人源性脂聯(lián)素球狀結(jié)構(gòu)(gAd)基因的原核表達(dá)載體,建立工程菌菌種庫,進(jìn)行中試規(guī)模的擴(kuò)大發(fā)酵培養(yǎng);優(yōu)化發(fā)酵工藝和純化工藝;并對表達(dá)純化產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。
　　2.通過對蛋白激酶(AMPK)的磷酸化水平和對小鼠的心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用來檢測純化蛋白的生物學(xué)活性。
　　實(shí)驗方法:
　　1.從正常人脂肪組織里提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,經(jīng)PCR擴(kuò)增、酶切后連入pET

5、-22b(+)載體構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-22b(+)-gAd。
　　2.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)低溫、低濃度IPTG誘導(dǎo)使其可溶性表達(dá),采用硫酸銨沉淀、凝膠過濾層析和陰離子交換層析三步分離純化,得到不帶任何標(biāo)簽高純度的人源性gAd。
　　3.建立中式發(fā)酵工藝和中式純化工藝,運(yùn)用SDS-PAGE、Westernblotting、HPLC對重組蛋白進(jìn)行鑒定。
　　4.通過對蛋白激酶(AMPK)的

6、磷酸化水平和對小鼠的心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用來檢測純化蛋白的生物學(xué)活性。
　　實(shí)驗結(jié)果:
　　1.成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-22b(+)-gAd,實(shí)現(xiàn)了人源性gAd在原核細(xì)胞中的表達(dá),優(yōu)化了發(fā)酵工藝,使目的蛋白以可溶性形式表達(dá);
　　2.連續(xù)三批發(fā)酵生長良好,發(fā)酵工藝穩(wěn)定、可靠;連續(xù)三批純化結(jié)果表明,所獲蛋白純度均大于97％,每批可得到純化產(chǎn)物100mg以上,達(dá)到了中試生產(chǎn)的要求,建立了穩(wěn)定、可靠的中試純化工藝

7、。
　　3.活性研究結(jié)果表明,純化的人源性gAd能夠明顯的激活HUVECs中AMPK的磷酸化水平以及對小鼠的心肌缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用
　　結(jié)論:
　　1.本研究通過對人源性脂聯(lián)素球狀結(jié)構(gòu)(gAd)原核表達(dá)載體的構(gòu)建、中試規(guī)模的發(fā)酵與純化研究,建立了簡單、快速、穩(wěn)定、可靠的生產(chǎn)工藝,獲得了高純度的人源性脂聯(lián)素球狀結(jié)構(gòu)(gAd),通過對AMPK的磷酸化水平的檢測和對小鼠的心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用證明純化出的gAd