豬源OAS蛋白抗JEV的特性研究.pdf

1、日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)，又稱流行性乙型腦炎病毒，為單股正鏈RNA病毒，與西尼羅河病毒(WNV)、登革熱病毒(DENV)、蜱傳性腦炎病毒(TBEV)和黃熱病病毒(YFV)等醫(yī)學上重要的致病性病毒同屬于黃病毒科黃病毒屬。流行性乙型腦炎(epidemic encephalitis B/JE)是由JEV引起的一種重要的蚊媒性人獸共患傳染病，主要引發(fā)人類的腦炎和豬的繁殖障礙性疾病，其爆發(fā)或流

2、行具有明顯的季節(jié)性和地區(qū)性。隨著JE的流行和擴散，該病極有可能成為一種全球性傳染病，嚴重威脅人類和動物的健康，因此，切實有效地防控JEV對于建立健康良好的全球公共衛(wèi)生環(huán)境具有積極重要的意義。
　　2'-5'寡腺苷酸合成酶（2'-5'Oligoadenylate Synthesis，OAS）是一種由Ⅰ型或Ⅱ型干擾素(Interferon，IFN)誘導產生的抗病毒蛋白，在IFN介導的抗病毒通路中發(fā)揮重要作用，同時也參與其它的細胞進程，

3、例如細胞凋亡、細胞生長與分化、基因調控、DNA復制及RNA剪切等。目前，關于哺乳動物OAS蛋白的生物學活性（尤其是抗病毒活性）已有愈來愈多的研究報道，但與其相關的生物作用機制并未被揭示清楚，仍然有待后續(xù)的探討與研究。
　　OAS基因屬于一個保守的基因家族，與其它的干擾素刺激基因（Interferon-stimulated gene，ISG）不存在明顯的序列同源性。OAS家族由四個不同亞型組成:OAS1，OAS2，OAS3和OASL

4、。豬源OAS與人源和鼠源的OAS具有高度的同源性。豬源OAS1與人源OAS1具有73％的序列同源性，并且具有相似的酶催化特性。OAS蛋白的重要功能是利用ATP催化合成2'-5'寡腺苷酸(2-5A)，隨后2-5A激活核糖核酸內切酶(RNaseL)，活化的RNaseL能夠降解胞內的病毒RNA和細胞RNA，從而導致在病毒感染過程中細胞肉蛋白的合成整體受到抑制，病毒的增殖隨之受到抑制。
　　黃病毒的抗性基因(Flvr)已被兩個研究團隊分別

5、證實為OAS1b基因，且在野生小鼠中能夠抑制西尼羅河病毒(WNV)的增殖。Lin等發(fā)現(xiàn)人源的OAS1(p42、p46)和OAS3(p100)具有較強的抗登革熱病毒(DENV)的活性。Kwon等證實OAS1(p46)和OAS3(p100)是依賴于RNase L從而抑制丙肝病毒(HCV)的感染。此外，外源性OAS1能夠進入細胞內，并且無論在體內或體外均具有強大的抗病毒活性。此后，Thavachelvam等發(fā)現(xiàn)外源性OAS1在病毒復制早期發(fā)揮

6、重要作用。人的OAS1的SNP(rs10774671)上的等位基因A，不僅與OAS1的剪切及其酶活性相關，而且影響OAS抗WNV的活性，可作為人類初次感染WNV的風險標志基因。此外，Bigham等發(fā)現(xiàn)，OAS1的另外1個SNP(rs34137742)也與顯性感染WNV有關，并關系到該疾病的發(fā)展進程。Rios等研究表明，馬的OAS1具有抵抗WNV感染的活性，其在自然條件下發(fā)生的單核苷酸突變會增加宿主對WNV的易感性?？紤]到JEV與WNV的

7、親緣關系相近，可以推測OAS基因的多態(tài)性可能也與JEV的易感性相關，但該方面的研究有待進一步開展。
　　1.豬源OAS蛋白抗JEV感染的特性
　　2'-5'寡腺苷酸合成酶(OAS)是一類具有抗病毒活性的蛋白，并且人源和鼠源的多種亞型已被證實能夠作為抗黃病毒的生物標志。本實驗探究發(fā)現(xiàn)豬源OAS家族基因在PK-15細胞中的表達規(guī)律呈現(xiàn)時間依賴性的特點。JEV感染能夠刺激OAS1快速高效地表達，在24hpi升高5.7倍，表達效率明

8、顯高于OAS2（3.1倍）和OASL（1.5倍）。PK-15細胞瞬時過表達OAS1a和OASL能夠顯著抑制JEV的增殖。而RNA干擾技術介導的OAS2基因的瞬時沉默更能促進JEV的增殖，促使病毒基因組上升7.99倍，顯著高于OAS1和OASL組的4.5倍。共同沉默OAS基因和RNase L基因的結果表明，OAS1和OAS2依賴于OAS/RNase L途徑發(fā)揮抗JEV的活性，而OASL具有其它的抗病毒途徑。綜上，豬源OAS各亞型在抗JEV

9、感染過程中發(fā)揮重要作用，但對于具有特殊蛋白結構的OASL，其抗病毒機制仍需更加深入的研究。
　　2.豬源OAS1基因SNP對JEV感染的影響
　　人源OAS1的多態(tài)性已被證實與多種具有重要公共衛(wèi)生意義的感染性疾病的不同易感性相關，包括丙肝病毒(HCV)、SARS冠狀病毒和西尼羅河病毒。豬的OAS1蛋白也具有抗JEV的活性。本研究旨在探究豬OAS1的單核苷酸多態(tài)性(SNP)對JEV病毒感染的影響。本實驗利用原有不同品種和乙腦發(fā)

10、病狀況的豬的組織樣品的測序結果分析得到18個非同義編碼區(qū)的SNP，并據此位點進行OAS1基因的單核苷酸突變構建真核表達載體。試驗結果發(fā)現(xiàn)，M13(Q174K)和M16(D277N)兩個突變體可能因為單個氨基酸突變而引起蛋白發(fā)生變化，從而導致抗病毒活性的顯著缺失，即上述兩組的病毒基因組分別為對照組的87.1％和97.2％。然而回溯分析并未確定突變位點與JEV易感性的關聯(lián)顯著。此外，OAS1及其突變體在IFN系統(tǒng)不完整的BHK-21和Ver