外源dsRNA-siRNA介導(dǎo)的玉米粘蟲RNA干擾機(jī)制的研究.pdf

1、RNA干擾是一種廣泛存在于真核生物細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機(jī)制。該機(jī)制由內(nèi)源性或外源性長鏈dsRNA介導(dǎo)，被RNaseⅢ家族核酸內(nèi)切酶Dicer切割成21-25nt長度的雙鏈siRNA后，與Argonaute蛋白和Dicer酶復(fù)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)，在RISC的引導(dǎo)下，雙鏈siRNA中的反義鏈與相應(yīng)靶標(biāo)mRNA特異性結(jié)合，在核酸內(nèi)切酶的作用下使靶標(biāo)mRNA降解從而引起基因沉默。
　　本研究使用鱗翅目夜蛾科昆

2、蟲玉米粘蟲（Mythimna separata）作為研究材料，選擇高表達(dá)且影響玉米粘蟲生長發(fā)育的關(guān)鍵基因β-actin作為RNA干擾的靶標(biāo)基因，以喂飼法將dsRNA以及siRNA導(dǎo)入昆蟲體內(nèi)，通過小RNA測序的方法，研究RNA干擾效應(yīng)所產(chǎn)生的siRNA的結(jié)構(gòu)和豐度等，檢測到了長度為18-35nt的小RNA。對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行整理以及reference mapping、small RNA coverage和lengthdistribution

3、等生物信息學(xué)分析后發(fā)現(xiàn):(1)在靶標(biāo)基因的正鏈和負(fù)鏈都出現(xiàn)了不同程度的小RNA富集情況且存在若干明顯的小RNA高豐度熱點(diǎn)區(qū)域;(2)在負(fù)鏈上檢測到的小RNA富集僅出現(xiàn)在dsRNA導(dǎo)入?yún)^(qū);(3)在正鏈上導(dǎo)入?yún)^(qū)和導(dǎo)入?yún)^(qū)之外均檢測到了小RNA的存在，由于玉米粘蟲體內(nèi)并未發(fā)現(xiàn)RdRp及其同源基因，這可能歸結(jié)于其它與RdRp具有相似功能的內(nèi)源性聚合酶，使siRNA誘導(dǎo)的mRNA降解效應(yīng)擴(kuò)展至導(dǎo)入?yún)^(qū)之外，使非導(dǎo)入?yún)^(qū)mRNA降解成短片段并產(chǎn)生正鏈上的

4、熱點(diǎn)區(qū)富集。為驗(yàn)證小RNA測序分析結(jié)果，我們進(jìn)行了Northern雜交檢測并證實(shí)了熱點(diǎn)區(qū)富集現(xiàn)象的存在，且具有鏈特異性。另外，通過qPCR實(shí)驗(yàn)檢測到了RNA干擾效應(yīng)對β-actin基因的表達(dá)抑制現(xiàn)象，而且其結(jié)果與小RNA測序得到的靶位點(diǎn)切割結(jié)果相吻合。
　　目前，利用RNA干擾技術(shù)對昆蟲的內(nèi)源基因進(jìn)行干擾抑制的實(shí)驗(yàn)多有報(bào)道。而且RNA干擾介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因抗蟲植物的培育是昆蟲生物防治的一個(gè)新的研究課題，但是對昆蟲RNA干擾機(jī)制，尤其其中