dsRNA和重組TMV介導(dǎo)的針對(duì)玉米黏蟲Chitinase基因的RNA干擾研究.pdf

1、RNAi(RNA interference，RNA干擾)是序列特異的基因沉默技術(shù)。RNAi在植物抗病領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，2007年美國Monsanto公司及中國科學(xué)院研究人員利用RNAi技術(shù)分別獲得了抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米和棉花，為農(nóng)業(yè)害蟲的防控提供了新的思路和途徑。玉米粘蟲是屬于鱗翅目夜蛾科的非常重要的農(nóng)藥害蟲。近幾年，玉米粘蟲在我國華北地區(qū)爆發(fā)成災(zāi)，迫切需要探索有效的控制途徑。
　　本實(shí)驗(yàn)中挑選了對(duì)粘蟲生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要的chitin

2、ase基因做為候選基因，設(shè)計(jì)合成和檢測(cè)了抑制chitinase基因的干擾RNA序列。為了達(dá)到RNAi效果，我們?cè)O(shè)計(jì)了兩個(gè)實(shí)驗(yàn)。第一，體外合成針對(duì)靶基因的dsRNA，并與人工飼料混勻，飼喂玉米粘蟲。第二，為了檢測(cè)植物體內(nèi)表達(dá)的dsRNA所介導(dǎo)的RNAi效應(yīng)，本研究將干擾片段克隆到植物病毒載TMV(PJL36)，并將重組載體侵染了本氏煙草。TMV病毒的復(fù)制過程會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)插入序列對(duì)應(yīng)的dsRNA，將其飼喂給玉米粘蟲，以期在玉米粘蟲體內(nèi)產(chǎn)生針對(duì)

3、靶基因的RNA干擾效應(yīng)。
　　隨后，本研究通過測(cè)定以下指標(biāo)來檢測(cè)了上述兩種方法介導(dǎo)的RNAi效應(yīng)。熒光定量PCR結(jié)果表明，chitinase1和chitinase2基因的表達(dá)量降低，同時(shí)也利用序列特異的探針檢測(cè)到了對(duì)應(yīng)的siRNA，說明通過體外合成的dsRNA和植物體病毒復(fù)制所產(chǎn)生的干擾RNA被玉米粘蟲體吸收后均引起了RNAi效應(yīng)。另外，chitinase1、chitinase2基因的干擾導(dǎo)致了受試玉米粘蟲的體重減少及死亡率增加。