人胰島細(xì)胞制備過程中細(xì)菌性污染的監(jiān)測與干預(yù).pdf

1、研究背景： 胰島移植以其安全、簡便、利于體外移植物修飾、不良反應(yīng)低等優(yōu)點成為現(xiàn)今糖尿病治療領(lǐng)域的研究熱點。胰島移植已經(jīng)可以使1型糖尿病患者長期保持血糖正常和非胰島素依賴。隨著胰島分離、純化技術(shù)的不斷改進以及新型免疫抑制劑的問世和應(yīng)用，臨床同種異體胰島移植已取得令人矚目的進展。近年來干細(xì)胞誘導(dǎo)、基因修飾、免疫耐受等技術(shù)的發(fā)展也取得長足進步，免疫排斥及移植細(xì)胞數(shù)量問題逐漸被改善后，細(xì)胞制備和培養(yǎng)過程中微生物污染的現(xiàn)象就凸現(xiàn)出來，與實

2、體器官移植相比，感染的機率已大大增加。對于移植后排斥反應(yīng)導(dǎo)致免疫系統(tǒng)功能低下的患者來說，感染可能是致命的，一旦發(fā)生，難以控制。因此，在胰島細(xì)胞制備中預(yù)防性使用敏感抗生素對胰腺、胰島細(xì)胞進行處理，并分步驟取樣進行微生物鑒定，評價污染情況，采取必要的干預(yù)措施，預(yù)防并清除細(xì)胞制備過程中出現(xiàn)的污染有十分重要的意義。 目的： 本實驗在胰島細(xì)胞制備過程中監(jiān)測并預(yù)防性使用敏感抗生素，防止、清除制備過程中出現(xiàn)的污染，保證用于移植的胰島細(xì)

3、胞質(zhì)量，以期減少移植后感染的發(fā)生，確保移植進一步用于臨床的效果。 方法： 1、成人胰島細(xì)胞的分離純化及其過程中細(xì)菌性污染的監(jiān)測：在胰腺從手術(shù)室轉(zhuǎn)移至實驗室后的尸胰組織袋中；胰腺進行修剪、灌注后；胰島細(xì)胞消化收集中；胰島細(xì)胞孵育前；COBE-2991細(xì)胞純化機純化胰島細(xì)胞后；體外培養(yǎng)48小時后六個步驟取樣進行細(xì)菌性污染的鑒定。并作藥敏實驗。 2、在同樣的制備過程中設(shè)A、B兩組，分別采用青霉素+鏈霉素+兩性霉素B或泰

4、能+兩性霉素B進行干預(yù)，未施加干預(yù)措施作為對照組。 3、胰島細(xì)胞的功能測定：采用體外胰島素釋放試驗，測定純化培養(yǎng)后未被污染的胰島細(xì)胞功能。 結(jié)果： 1、未加抗生素干預(yù)在分離純化中主要的操作步驟均存在細(xì)菌性的污染(25％～75％)，尤其是培養(yǎng)后其污染率達100％，使用抗生素干預(yù)的A、B組在操作過程中仍然發(fā)生污染，但培養(yǎng)后的污染率分別為50％、0％。微生物鑒定約72％為革蘭氏陰性桿菌，藥敏均對亞胺培南敏感。細(xì)菌譜顯示

5、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌等實驗室及院內(nèi)常見污染菌可出現(xiàn)在操作的不同環(huán)節(jié)。 2、三組不同處理的胰島細(xì)胞(純化培養(yǎng)后)的污染率分別為：對照組(未用抗生素)100％、A組(青霉素+鏈霉素+兩性霉素B)50％、B組(泰能+兩性霉素B)0％。經(jīng)統(tǒng)計分析：三種不同方案對減少胰島細(xì)胞制備過程中的污染率有顯著性差異(P＜0.05)。 3、取培養(yǎng)后未污染的胰島細(xì)胞行體外胰島素釋放試驗(A組=3，B組=7)。A、B組兩組胰島細(xì)胞在高糖(

6、16.7mmol/L)時胰島素釋放量與低糖(3.3mmol/L)相比有顯著性差異(P＜0.05)，高糖時胰島素釋放量分別是低糖的2.41和2.36倍，提示A、B組胰島細(xì)胞分泌功能良好。兩組間的ISI在統(tǒng)計學(xué)上也無顯著差異(P=0.76)，說明兩組抗生素對胰島細(xì)胞功能的影響無差異。 結(jié)論： 胰島細(xì)胞制備過程中細(xì)菌性污染嚴(yán)重。泰能/兩性霉素B的聯(lián)合應(yīng)用能有效清除胰島細(xì)胞制備過程中出現(xiàn)的細(xì)菌性污染，經(jīng)泰能+兩性霉素B處理的胰島