藥物干預(yù)對吸煙誘導(dǎo)COPD大鼠模型作用的研究.pdf

1、[目的]建立大鼠慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型，觀察N-乙酰半胱氨酸(NAC)、布地奈德，茶堿單獨或聯(lián)合使用對COPD氧化還原反應(yīng)、核因子-κB(NF-κB)和組蛋白去乙?；?HDAC)血液和肺內(nèi)表達的影響，探討單藥與聯(lián)合用藥對吸煙導(dǎo)致COPD作用是否存在差異；探討ROS、NF-κB和HAT/HDAC在COPD發(fā)病中的作用，以期為闡明COPD的發(fā)病機制和COPD的治療提供基礎(chǔ)依據(jù)。 [方法]36只健康雄性Wistar大鼠隨機

2、分為健康對照組(C)、COPD模型組(M)、NAC干預(yù)組(N)、布地奈德干預(yù)組(B)、NAC加布地奈德干預(yù)組(NB)、布地奈德組加茶堿干預(yù)組(BT)，每組均為6只。采用熏香煙加氣管內(nèi)注入脂多糖(LPS)法建立大鼠COPD模型。NAC組于COPD模型開始建立時予NAC(400mg/kg)胃飼，每日1次，每次2ml；B組于COPD模型建立時于布地奈德霧化吸入每日1次，該組每次吸入2mg/2ml；NB組于第8日起加布地奈德霧化吸入，劑量同上；

3、BT組于COPD模型建立時于給予茶堿；各組均連續(xù)用藥4周。COPD模型建立后，觀察內(nèi)容如下： 1、光鏡下觀察肺部病理學(xué)變化。 2、支氣管肺泡灌洗液(BALF)細胞計數(shù)和分類。 3、分光光度法測定血清中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)含量。 4、活性氧測定試劑盒測定血清中抗活性氧單位量。 5、免疫組化法觀察肺內(nèi)、核因子-κB(NF-κB)、組蛋白去乙酰化酶(HDAC)的表達情況。

4、6、RT-PCR測定肺組織中HDAC基因表達的情況。 7、掃描電鏡觀察氣道粘膜表面及肺泡超微結(jié)構(gòu)變化特點。 [結(jié)果] 1、所建大鼠COPD模型的病理組織學(xué)改變符合人類COPD的特點。各COPD造模組氣管、支氣管及肺組織有慢性氣管炎、阻塞性肺氣腫的特征性病理改變。光鏡下觀察蘇木素/伊紅(HE)染色切片，肺氣腫模型組肺泡管、肺泡囊和肺泡明顯擴張肺泡壁變薄，并有不同程度的斷裂。NAC組、NB組、BT組大鼠肺泡壁斷裂和肺

5、泡腔擴張情況明顯減輕；與正常對照組比較，COPD模型組和B組平均內(nèi)襯間隔(MLI)顯著增加，差異有顯著性(P＜0.05)，平均肺泡數(shù)(MAN)顯著較少，差異有顯著性(P＜0.05)；與COPD模型組比較，NAC干預(yù)組、NB組大鼠MLI顯著較少，差異有顯著性(P＜0.05)，MAN顯著增加，差異有顯著性(P＜0.05)。 2、各組BALF中有核細胞總數(shù)及分類與對照組相比，模型組、NAC組、NB組、B組及BT組BALF白細胞總數(shù)及中

6、性粒細胞的絕對數(shù)顯著增加，差異有顯著性(P＜0.01)；單核巨噬細胞所占構(gòu)成比顯著降低，差異有顯著性(P＜0.01)，但其絕對數(shù)則增加。與模型組比較，NAC組BALF中白細胞總數(shù)及分類構(gòu)成比與COPD模型組比較無顯著差異(P＞0.05)；NB組BALF中白細胞總數(shù)及中性粒細胞較NAC組顯著降低，差異有顯著性(P＜0.05)，肺泡巨噬細胞所占比例明顯高于NAC組，差異有顯著性(P＜0.05)。B組BALF中白細胞總數(shù)及分類構(gòu)成比與COPD

7、模型組比較無顯著差異(P＞0.05)；BT組BALF中白細胞總數(shù)及中性粒細胞較COPD組顯著降低，差異有顯著性(P＜0.05)，較B組無明顯變化(P＞0.05)。 3、血清中SOD、Anti-ROS、MDA含量與對照組相比，模型組、NAC組、B組及BT組血清中SOD含量明顯降低差異有顯著性，(P＜0.05)，血清抗活性氧單位明顯降低，差異有顯著性(P＜0.05)，MDA明顯增高，差異有顯著性(P＜0.05)；NB組則與對照組無明

8、顯差異(P＞0.05)。 4、組織NF-κB、HDAC2的表達 NF-κB免疫組化結(jié)果：NF-κB可表達于血管內(nèi)皮細胞、細支氣管上皮細胞及炎癥細胞，正常對照組呈弱陽性免疫反應(yīng)。COPD模型組與正常對照組比較，NF-κB呈強陽性免疫反應(yīng)，COPD模型組陽性細胞免疫反應(yīng)產(chǎn)物的相對含量較正常對照組比較明顯升高，差異有顯著性(P＜0.01)。NAC治療組，明顯高于正常對照組，差異有顯著性(P＜0.01)。NB組NF-κB在胞核、

9、胞漿中表達則呈弱陽性。NB組NF-κB在胞核、胞漿中表達呈弱陽性到陽性表達，NB組與NAC組比較，NF-κBP65在胞核中陽性反應(yīng)明顯減輕，差異有顯著性(P＜0.05)。B組NF-κB蛋白陽性細胞表達強度與正常對照組比較明顯升高，差異有顯著性(P＜0.01)，與COPD模型組則無明顯差異(P＞0.05)；BT組NF-κB在胞核、胞漿中均呈陽性反應(yīng)，較B組明顯下降，差異有顯著性(P＜0.05)。 HDAC2免疫組化結(jié)果：HDAC2

10、可表達于細支氣管上皮細胞和炎癥細胞，正常對照組呈陽性免疫反應(yīng)，陽性反應(yīng)產(chǎn)物多分布在核中，胞漿中極少見陽性免疫反應(yīng)物質(zhì)。COPD模型組HDAC2呈弱陽性免疫反應(yīng)，HDAC2陽性細胞表達強度與正常對照組比較明顯降低，差異有顯著性(P＜0.01)，與NAC治療組下降不明顯(P＞0.05)，與NB組比較明顯下降，差異有顯著性(P＜0.05)。NAC治療組HDAC2在胞核中呈陽性反應(yīng)，其陽性百分率表達與健康對照組比較無顯著性差異(P＞0.05)。

11、NB組HDAC2在胞核表達呈陽性表達。NB組與正常對照組比較，HDAC2在胞核中陽性反應(yīng)無顯著性差異(P＞0.05)；與NAC治療組比較無顯著性差異(P＞0.05)。B組HDAC2呈弱陽性免疫反應(yīng)，與對照組比較顯著降低，差異有顯著性(P＜0.01)，與COPD模型組比較無顯著性差異(P＞0.05)；BT組HDAC2呈陽性免疫反應(yīng)，與對照組比較顯著降低，差異有顯著性(P＜0.05)，與COPD模型組比較顯著增加，差異有顯著性(P＜0.05

12、)，與B組比較無顯著性差異(P＞0.05)。 5、RT-PCR測定肺組織中HDACmRNA使用AlphaInnotech軟件分析，讀取各條帶光密度，其中β-actin的光密度固定為26.71，求出各組HDAC2與β-actin的光密度值比值，代表HDAC2mRNA表達情況。COPD模型組、B組、NB組、NAC組和BT組的HDAC2Mrna表達量都明顯高于正常對照組，差異有顯著性(P＜0.01)，除COPD模型組和B組間無顯著性差

13、異(P＞0.05)，其他各組間均有顯著性差異(P＜0.01)。 5、支氣管粘膜掃描電鏡觀察COPD模型組及B組大鼠支氣管柱狀上皮細胞纖毛成大片倒伏，凌亂，失去正常形態(tài)，有廣泛區(qū)域纖毛脫落；杯狀細胞肥大，增生明顯，大量炎性細胞浸潤。正常對照組大鼠支氣管柱狀上皮細胞纖毛排列規(guī)則，呈“麥浪”起伏狀，杯狀細胞飽滿無增生，無炎性細胞侵潤。NAC干預(yù)組、NB組及BT組大鼠支氣管柱狀上皮細胞纖毛部分倒伏，部分區(qū)域出現(xiàn)纖毛脫落；杯狀細胞輕度增生

14、，輕度炎性細胞浸潤；但NAC干預(yù)組、NB組和BT組間無明顯差異。 [結(jié)論]1吸煙可引起體內(nèi)抗氧化能力的下降，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的增加，NF-κB的強烈表達，組蛋白乙?；皆黾?，HDAC的抑制和破壞，引起肺部炎癥反應(yīng)和激素抑制，改變肺部氧化還原平衡，引起COPD發(fā)病。 2NAC可以抗氧化、減弱炎癥反應(yīng)，抑制NF-κB在肺組織的表達，降低吸煙對HDAC的抑制和破壞，增加組蛋白的乙?；?3布地耐德在減弱肺部炎癥、抑制N