CDMP1誘導(dǎo)ADSCs修復(fù)軟骨損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、關(guān)節(jié)軟骨是一種允許可動(dòng)關(guān)節(jié)進(jìn)行光滑無摩擦運(yùn)動(dòng)的特殊的狹窄層連組織。它由數(shù)量相對(duì)較少的埋植在胞外基質(zhì)里的軟骨細(xì)胞組成。胞外基質(zhì)主要包含II型膠原，蛋白聚糖和水,伴隨著數(shù)量更少的其它類型膠原和非膠原蛋白。創(chuàng)傷、骨性關(guān)節(jié)炎(OA)以及關(guān)節(jié)軟骨病都能造成軟骨組織的損傷，嚴(yán)重的影響了患者的生活質(zhì)量,關(guān)節(jié)置換手術(shù)仍然是緩解患者疼痛的最終選擇。
　　軟骨組織的損傷可在多個(gè)關(guān)節(jié)發(fā)病，但多數(shù)發(fā)生在髖關(guān)節(jié)和膝關(guān)節(jié)，國人多累及膝關(guān)節(jié)，尤其多見于絕經(jīng)后女

2、性。關(guān)節(jié)軟骨一旦被破壞，病變將逐步發(fā)展，可導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨下骨的硬化、囊性變，關(guān)節(jié)囊增厚、纖維化等，最終關(guān)節(jié)變形，功能喪失。
　　而關(guān)節(jié)軟骨的損傷是不易修復(fù)的。損傷的關(guān)節(jié)軟骨自我修復(fù)的能力極其有限。關(guān)節(jié)面過度損傷的治療效果是不樂觀的，通常容易發(fā)展為骨性關(guān)節(jié)炎。由于軟骨自發(fā)修復(fù)能力的局限性,輕度關(guān)節(jié)軟骨損傷會(huì)使損傷發(fā)展甚至退變。關(guān)節(jié)軟骨的退變是臨床的挑戰(zhàn)之一，它缺乏令人信服的治療策略。
　　近年來，組織工程倍受學(xué)者的青睞。它的核心

3、是活的細(xì)胞、可供細(xì)胞進(jìn)行生命活動(dòng)的支架材料以及細(xì)胞與支架材料的相互作用，這是組織工程學(xué)研究的主要科學(xué)問題。種子細(xì)胞、可降解的支架材料與細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子并稱為組織工程的三大基本要素。
　　組織工程學(xué)的發(fā)展使人們開始尋找具有強(qiáng)大的體外增殖力和多向系分化的干細(xì)胞。但種子細(xì)胞的來源和細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子是組織工程的難題之一。
　　近年有學(xué)者注意到，在某些病理情況下脂肪中有異位骨形成，這表明脂肪組織中可能存在某些細(xì)胞可分化為其他組織細(xì)胞。

4、脂肪組織抽取后殘留于供區(qū)的脂肪組織仍可擴(kuò)增，且肥胖人群也越來越多，許多人主動(dòng)要求抽吸脂肪，所以容易大量獲得，對(duì)供區(qū)的損傷也小，這就使其自然成為干細(xì)胞生物工程研究的理想來源。CDMP1現(xiàn)已了解骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein。BMP)家族中一類特異生長因子——軟骨源性形態(tài)發(fā)生蛋白(cartilage－derived morphogenetic protein CDMP)在軟骨發(fā)育過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用

5、。在目前所發(fā)現(xiàn)的BMP全部家族成中，CDMP1是最為特異的與軟骨形態(tài)發(fā)生與發(fā)育相關(guān)的一類生長因子，它在出生后可繼續(xù)維持正常軟骨組織的生長并促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨的損傷修復(fù)過程。CDMP主要通過調(diào)節(jié)間質(zhì)前體細(xì)胞的分化、參與了軟骨組織的發(fā)生、生長與損傷修復(fù)的幾乎全部生物學(xué)過程，是重要的調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞分化的生長因子。
　　本試驗(yàn)在體外和體內(nèi)二個(gè)水平研究了CDMP1誘導(dǎo)大鼠脂肪干細(xì)胞(ADSCs)成軟骨的研究。
　　首先在體外利用不同濃度劑量的

6、CDMP1誘導(dǎo)大鼠脂肪干細(xì)胞（ADSCs），利用MTT法測(cè)定CDMP1對(duì)ADSCs增殖分化的影響；然后復(fù)合自制牛松質(zhì)骨支架植入裸鼠腋窩下，定期觀察裸鼠體內(nèi)成軟骨的情況；最后用CDMP1誘導(dǎo)的ADSCs復(fù)合牛松質(zhì)骨支架，修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損，探討探討異種軟骨細(xì)胞作為軟骨組織工程種子細(xì)胞的可行性。本研究的內(nèi)容和結(jié)果如下。
　　1.MTT法測(cè)定CDMP1對(duì)ADSCs增殖分化的影響
　　取第二代ADSCs細(xì)胞，以1X103個(gè)/孔密度

7、接種于5塊平底96孔培養(yǎng)板里。每板分ABCD四組，對(duì)照組(D組)加基礎(chǔ)培養(yǎng)液，誘導(dǎo)組（A，B，C組）加相應(yīng)的誘導(dǎo)培養(yǎng)液。每隔1d檢測(cè)1塊，分析CDMP1對(duì)ADSCs的增殖能力的影響。結(jié)果表明，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)組A,誘導(dǎo)組B，誘導(dǎo)組C的細(xì)胞比對(duì)照組D同期增殖力強(qiáng)，尤以C組為最。10d后，A，B，C三組細(xì)胞仍有增殖趨勢(shì)，D組細(xì)胞則已成下降趨勢(shì)。各組細(xì)胞在第10d的吸光值，經(jīng)方差分析及LSD-t檢驗(yàn)，A，B，C三組分別與D組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.

8、05）；但A，B，C三組之間并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）故提示CDMP1誘導(dǎo)的最佳濃度約為50ng/mL，可用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。
　　2.CDMP1誘導(dǎo)ADSCs體外成軟骨細(xì)胞的作用
　　取生長良好的第二代ADSCs細(xì)胞以1X103個(gè)/孔的密度接種于24孔的培養(yǎng)板里，孔底放置由多聚賴氨酸包被的蓋玻片。每板分ABCD四組:對(duì)照組（D組）加基礎(chǔ)培養(yǎng)液（10mL/L新生牛血清-DMEM）培養(yǎng)，誘導(dǎo)組（A，B，C組）于細(xì)胞爬片12h后

9、，分別加入相應(yīng)的誘導(dǎo)液（A組：50ng/mLCDMP1+基礎(chǔ)培養(yǎng)液；B組：100ng/mL CDMP1+基礎(chǔ)培養(yǎng)液;C組：150ng/mL+基礎(chǔ)培養(yǎng)液）。每2d換液一次。37℃CO2箱里培養(yǎng)14d。分別行細(xì)胞形態(tài)變化學(xué)觀察、Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)、GAG定性檢測(cè)。結(jié)果表明，CDMP1誘導(dǎo)大鼠脂肪干細(xì)胞可以分泌軟骨特異性基質(zhì)糖胺聚糖（GAG）和Ⅱ型膠原，并使其向軟骨方向增殖分化。
　　3.掃描電鏡下自制牛松質(zhì)骨支架和誘導(dǎo)細(xì)胞－支架復(fù)合

10、物的形態(tài)觀察
　　掃描電鏡示：軟骨細(xì)胞和經(jīng)CDMP1誘導(dǎo)的ADSCs在自制牛松質(zhì)骨支架上均生長良好。自制牛松質(zhì)骨支架孔隙率適中，平均孔徑約為382um。為細(xì)胞提供了空間三維培養(yǎng)條件，這種培養(yǎng)方式有利于細(xì)胞獲得足夠的營養(yǎng)物質(zhì)和保持相互間的接觸和通信，使其按預(yù)制形態(tài)的三維支架生長。
　　4.CDMP1誘導(dǎo)ADSCs裸鼠體內(nèi)成軟骨的作用
　　將第二代ADSCs消化離心制成細(xì)胞懸液，以1X104/cm2密度用移液器復(fù)合于預(yù)濕的

11、松質(zhì)骨上，4h后加入誘導(dǎo)液（10mL/L新生牛血清-DMEM培養(yǎng)液+50ng/mL CDMP1）繼續(xù)體外培養(yǎng)2w。20只裸小鼠，左側(cè)腋窩皮下均埋入實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞-支架復(fù)合物（經(jīng)CDMP1誘導(dǎo)的ADSCs-支架復(fù)合物），右側(cè)腋窩皮下均埋入對(duì)照組細(xì)胞-支架復(fù)合物（軟骨細(xì)胞-支架復(fù)合物）。手術(shù)嚴(yán)格無菌操作。定期行組織學(xué)觀察，結(jié)果：8w時(shí)，甲苯胺藍(lán)染色示試驗(yàn)組陽性，細(xì)胞呈球形，可見軟骨陷窩；對(duì)照組陰性，細(xì)胞呈梭形。但兩組支架都已降解。CDMP1體外

12、誘導(dǎo)SD仔鼠ADSCs，復(fù)合自制牛松質(zhì)骨支架，裸鼠體內(nèi)可成軟骨。
　　5.CDMP1誘導(dǎo)ADSCs復(fù)合牛松質(zhì)骨支架修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)
　　20只新西蘭大白兔，戊巴比妥鈉1ml/kg麻醉兔，行雙側(cè)膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)切口，掀開髕骨，于膝關(guān)節(jié)面用磨鉆鉆直徑約4.0mm，深達(dá)髓腔的缺損，于左側(cè)膝關(guān)節(jié)植入松質(zhì)骨支架-CDMP1誘導(dǎo)的ADSCs復(fù)合物，作為試驗(yàn)組，植入物與膝關(guān)節(jié)表面相齊。于右側(cè)膝關(guān)節(jié)植入單純松質(zhì)骨支架為對(duì)照組。在8w、1