轉(zhuǎn)化缺失的無(wú)莢膜肺炎鏈球菌作為活疫苗候選菌株的安全性及保護(hù)效果評(píng)價(jià)研究.pdf

1、目的：
　　 肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae，S.pn）是一種定植于人體上呼吸道的主要病原體，能夠引起危及生命的肺炎、敗血癥、腦膜炎以及像鼻竇炎、中耳炎等常見(jiàn)性疾病。鑒于目前肺炎鏈球菌耐藥菌株的大量增加，研制安全性高、保護(hù)效果好的疫苗是遏制肺炎鏈球菌感染的迫切需要。
　　 肺炎鏈球菌多糖疫苗(PPV)及結(jié)合疫苗(PCV)存在生產(chǎn)成本高、菌株類(lèi)型覆蓋有限、血清型置換等弊端，于是本研究著眼于血清

2、型非依賴(lài)的減毒活菌疫苗的研發(fā)。本課題通過(guò)缺失肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化關(guān)鍵基因comE獲得轉(zhuǎn)化缺陷株，這類(lèi)菌株失去獲得外源基因的能力，因此不易發(fā)生毒力回復(fù)。在此基礎(chǔ)上我們構(gòu)建了轉(zhuǎn)化缺陷的無(wú)莢膜菌株，對(duì)其進(jìn)行安全性、保護(hù)效果方面的研究，評(píng)價(jià)其作為減毒活疫苗的可行性。
　　 方法：
　　 通過(guò)基因替代失活的方式獲得缺陷菌D39△cps、R6△comE、D39△cps△comE并進(jìn)行基因測(cè)序及計(jì)算體外轉(zhuǎn)化率來(lái)鑒定。安全性通過(guò)以下方面評(píng)價(jià):

3、不同劑量攻毒小鼠進(jìn)行生存率實(shí)驗(yàn);攻毒后采集并培養(yǎng)小鼠心臟血、鼻腔灌洗液、肺勻漿及腦勻漿觀(guān)察細(xì)菌定植情況;感染肺炎鏈球菌小鼠的肺部組織形態(tài)學(xué)觀(guān)察。保護(hù)效果通過(guò)以下方面評(píng)價(jià):活菌疫苗鼻腔免疫小鼠后，D39強(qiáng)毒株攻毒觀(guān)察小鼠生存率;19F感染后觀(guān)察小鼠鼻咽部及肺部細(xì)菌載量;通過(guò)ELISA法檢測(cè)血清特異性抗體IgG及其亞型效價(jià)、細(xì)胞因子IL-4、IL-10、IL-17A、IFN-γ水平。
　　 結(jié)果：
　　 成功構(gòu)建了缺陷菌R6

4、△comE、D39△cps△comE，外源基因整合率實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)化缺陷菌R6△comE、D39△cps△comE轉(zhuǎn)化率均為零，而R6、D39△cps轉(zhuǎn)化率在1.4％～2.4％之間。
　　 鼻腔感染野生D39的小鼠組，平均生存時(shí)間為1.5天;而感染D39△cps、D39△cps△comE、R6、R6△comE的小鼠，均可完全存活，生存率為100％,且在血和腦中未檢測(cè)到細(xì)菌，其鼻腔灌洗液和肺部定植量均顯著低于陽(yáng)性對(duì)照D39組。此外，在小

5、鼠的血液和腦勻漿中均無(wú)定植，表明這4株菌不侵入血液，不入腦。通過(guò)鼻腔感染后不同時(shí)間點(diǎn)肺部組織切片的觀(guān)察，發(fā)現(xiàn)comE缺陷菌株的肺部炎癥要輕于對(duì)應(yīng)野生菌，并且72h后感染這4株菌的小鼠肺部炎癥均基本恢復(fù)。
　　 粘膜免疫小鼠后，四組實(shí)驗(yàn)組均可產(chǎn)生高效價(jià)的血清IgG（IgG1、IgG2b為主）;與佐劑對(duì)照組相比，細(xì)菌刺激免疫組小鼠脾細(xì)胞均可產(chǎn)生較高水平的特異性IL-4、IL-10以及IL-17;四組疫苗均可顯著降低19F在鼻咽部及肺

6、部定植;R6、R6△comE、D39△cps、D39△cps△comE四組疫苗對(duì)致死性D39感染的保護(hù)效果分別為60％、70％、70％、50％。
　　 結(jié)論：
　　 無(wú)莢膜的R6、D39△cps以及轉(zhuǎn)化缺陷株R6△comE、D39△cps△comE不會(huì)使BALB/c小鼠致病。轉(zhuǎn)化缺陷菌株與野生菌株粘膜免疫均能夠有效刺激機(jī)體的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，有效抵D39強(qiáng)毒株的侵襲性感染和定植，保護(hù)效果之間無(wú)顯著性的差異。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)