肺炎鏈球菌減毒活菌疫苗D39△CPS-TA的安全性、免疫保護(hù)效果及機(jī)制研究.pdf

1、目的:肺炎鏈球菌是一種革蘭陽(yáng)性條件致病菌，可引起肺炎、敗血癥、腦膜炎、中耳炎等多種急性感染性疾病，在全世界范圍內(nèi)特別是發(fā)展中國(guó)家具有極高的發(fā)病率和病死率。疫苗是預(yù)防肺炎鏈球菌感染的有效手段。但目前可用的莢膜多糖疫苗和莢膜多糖蛋白結(jié)合疫苗均存在生產(chǎn)成本高、可覆蓋血清型有限及血清型置換等問(wèn)題，極大地限制了這些疫苗在低收入國(guó)家的推廣使用。因此近年來(lái)，新型肺炎鏈球菌疫苗一直是研究的熱點(diǎn)。
　　減毒活菌疫苗具有免疫原性強(qiáng)、血清型覆蓋廣、生產(chǎn)

2、成本較低等特點(diǎn)，是一類(lèi)具有發(fā)展?jié)摿Φ囊呙?，但其安全性必須重點(diǎn)考慮。本課題組在前期肺炎鏈球菌缺陷菌構(gòu)建實(shí)驗(yàn)中得到了一株2型無(wú)莢膜的肺炎鏈球菌突變株D39△CPS-TA。該菌株由于spd1672缺失致細(xì)菌磷壁酸表達(dá)量顯著減少，但其莢膜缺失的原因一直未知。該菌株高度減毒，高劑量感染不致小鼠死亡。我們嘗試將其作為減毒活菌疫苗免疫小鼠，初步發(fā)現(xiàn)可以產(chǎn)生一定的保護(hù)作用，有望開(kāi)發(fā)成商品化的減毒活菌疫苗。本研究擬在探索D39△CPS-TA莢膜缺失原因、

3、明確D39△CPS-TA基因背景的基礎(chǔ)上，系統(tǒng)性地評(píng)價(jià)其安全性和粘膜免疫小鼠的保護(hù)效果，并對(duì)其免疫保護(hù)機(jī)制進(jìn)行深入研究，為該疫苗的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:對(duì)D39△CPS-TA進(jìn)行全基因組測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果以相關(guān)實(shí)驗(yàn)證明其莢膜缺失的原因;通過(guò)小鼠毒力實(shí)驗(yàn)、感染小鼠肺組織病理評(píng)估、小鼠定植實(shí)驗(yàn)以及細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)來(lái)確定D39△CPS-TA的安全性;將D39△CPS-TA粘膜免疫C57BL/6J小鼠，通過(guò)評(píng)價(jià)疫苗對(duì)不同血清型的

4、肺炎鏈球菌定植和致死性感染的保護(hù)效果來(lái)評(píng)價(jià)D39△CPS-TA作為減毒活菌疫苗的有效性;最后利用免疫缺陷小鼠模型及相關(guān)體外實(shí)驗(yàn)，探討體液免疫反應(yīng)、T細(xì)胞免疫反應(yīng)及T細(xì)胞免疫反應(yīng)主要免疫亞型(Th1/Th2/Th17/Treg)在疫苗保護(hù)性中的作用。
　　結(jié)果:定量PCR結(jié)果顯示，D39△CPS-TA的莢膜合成相關(guān)基因cpsA-D的表達(dá)量均較D39野生菌下降約75％。全基因組測(cè)序結(jié)果分析顯示，D39△CPS-TA的cps基因簇上游調(diào)

5、控序列中出現(xiàn)點(diǎn)突變T→C(313713)，LacZ和GFP報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示，突變啟動(dòng)子的報(bào)告基因的表達(dá)量較野生型分別降低了80％和76％，提示該突變降低了啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄效率。
　　D39△CPS-TA高度減毒，作為活菌疫苗安全性較高:在動(dòng)物模型中，D39△CPS-TA鼻腔和腹腔1×108 CFU高劑量感染后，小鼠100％存活;HE染色顯示，感染D39△CPS-TA小鼠的肺部組織損傷和炎癥反應(yīng)較感染野生菌的小鼠輕，在感染后72小時(shí)恢復(fù)

6、到正常狀態(tài)，而感染野生菌小鼠肺組織可見(jiàn)嚴(yán)重的出血、壞死及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，且肺組織破壞不可恢復(fù)，感染72小時(shí)小鼠全部死亡;定植實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，D39△CPS-TA在小鼠體內(nèi)定植短暫定植，感染后72小時(shí)即可從小鼠體內(nèi)清除完畢，而D39野生菌則在感染后48小時(shí)仍大量存在(1×104CFU)于小鼠小鼠鼻腔灌洗液、肺組織、血液、腦組織中，且感染后48小時(shí)小鼠全部死亡。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)顯示，在高劑量感染(MOI=100)6小時(shí)狀態(tài)下，D39△CPS-TA對(duì)

7、肺上皮細(xì)胞和臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的毒性較輕（細(xì)胞存活率分別為75％和80％），與R6相似（細(xì)胞存活率分別為70％和75％）。
　　D39△CPS-TA與CT佐劑聯(lián)用粘膜免疫C57BL/6J小鼠，可顯著降低肺炎鏈球菌19F和TIGR4在小鼠上呼吸道中的定植，免疫小鼠鼻腔灌洗液和肺組織中的細(xì)菌載量為對(duì)照組小鼠的1/10左右，對(duì)D39、14型、3型、6B型感染的生存率保護(hù)分別是95％、80％、100％和80％，與陽(yáng)性對(duì)照23價(jià)莢膜多糖疫苗的保

8、護(hù)效果(70％-75％)相當(dāng)。
　　免疫缺陷小鼠的研究顯示:粘膜免疫D39△CPS-TA對(duì)體液免疫缺陷小鼠和T細(xì)胞免疫缺陷小鼠的定植和生存率均無(wú)保護(hù)作用，免疫小鼠體內(nèi)的19F載量與對(duì)照小鼠相當(dāng)，D39攻毒的免疫小鼠生存率為0％和20％。D39△CPS-TA特異的抗血清和脾細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)肺炎鏈球菌TIGR4的殺傷率均為70％左右。將IFN-γ、IL-4和IL-17缺陷的C57BL/6J小鼠D39△CPS-TA分別鼻腔免疫，進(jìn)行定植實(shí)

9、驗(yàn)和生存率實(shí)驗(yàn)，定植實(shí)驗(yàn)中，IFN-γ、IL-4缺陷小鼠對(duì)照組上呼吸道中的19F載量為免疫組的100倍左右，而免疫IL-17缺陷小鼠的19F定植量與對(duì)照小鼠無(wú)差別，說(shuō)明Th17型免疫反應(yīng)參與對(duì)細(xì)菌定植的保護(hù);D39生存率實(shí)驗(yàn)中，免疫IFN-γ、IL-17缺陷小鼠的生存率分別為60％和80％，而免疫IL-4缺陷小鼠全部死亡，說(shuō)明Th4型免疫反應(yīng)參與對(duì)小鼠生存率的保護(hù)。D39△CPS-TA免疫的C57BL/6J小鼠體內(nèi)存在大量Treg細(xì)胞，

10、多肽P17抑制Treg后，免疫小鼠的細(xì)菌定植量恢復(fù)到對(duì)照小鼠水平，小鼠生存率由70％降至15％，說(shuō)明D39△CPS-TA特異的Treg免疫反應(yīng)參與對(duì)細(xì)菌定植和小鼠生存率的保護(hù)。
　　結(jié)論:D39△CPS-TA cps調(diào)控序列的點(diǎn)突變導(dǎo)致細(xì)菌莢膜缺失，高度減毒，作為減毒活菌疫苗安全性較高。D39△CPS-TA粘膜免疫C57BL/6J小鼠，可抵抗多種不同血清型肺炎鏈球菌感染，具有良好的非血清型依賴(lài)的保護(hù)性。體液免疫反應(yīng)和T細(xì)胞免疫反應(yīng)