Smac模擬物SM-164對乳腺癌的放射增敏作用和機制研究.pdf

1、乳腺癌是女性最常見的腫瘤，是女性首要的腫瘤死亡原因。放射治療在乳腺癌的局部控制，特別是對于進行保守性手術病人，發(fā)揮關鍵性作用。但是腫瘤細胞固有的放射抵抗性降低了放射治療的效果。IAPs家族的主要作用是通過與活性的caspase-3、-7和-9結合，并且阻礙它們的功能，最終抑制凋亡形成、使腫瘤細胞得以存活。XIAP、cIAP-1和cIAP-2是IAPs家族的主要成員。Smac是一種線粒體蛋白，在凋亡過程中從線粒體中釋放，激活被cIAP-1

2、、XIAP等阻滯的caspase。SM-164是一個模擬Smac作用的小分子化合物。BCL-2家族對細胞凋亡發(fā)揮著開關的作用。BM-771是一種新合成的BCL-2抑制劑，可以拮抗BCL-2家族的抗凋亡作用。
　　 目的：評價SM-164在乳腺癌細胞中的放射增敏作用，探討SM-164放射增敏的作用機制。評估BM-771在乳腺癌細胞中的放射增敏作用。
　　 方法：(1)采用免疫印跡法檢測6個常見乳腺癌細胞的IAPs和BCL-

3、2家族蛋白表達和SM-164對cIAP-1的降解作用。利用ATPlite法分析SM-164和BM-771對腫瘤細胞的生長活性抑制。采用克隆形成實驗評價SM-164和BM-771的放射增敏作用。(2)細胞(SK-BR-3和MDA-MB-468)被分為4組：對照組、SM-164治療組、X線照射組和聯(lián)合治療組。通過觀察細胞形態(tài)變化、FACS分析、DNA梯度分析、活性PARP和活性caspase-3蛋白表達來確定SM-164的放射增敏的性質。利

4、用ELISA方法檢測caspase活性。利用caspase抑制劑和siRNA沉默阻斷SM-164的放射增敏作用。
　　 結果：(1)乳腺癌細胞具有IAPs和BCL-2家族蛋白的異常表達。在4個cIAP-1高表達的乳腺癌細胞，SM-164能引起乳腺癌細胞cIAP-1的快速降解。高表達cIAP-1的乳腺癌細胞株對BM-771敏感，但BM-771無放射增敏作用；SM-164被大部分高表達cIAP-1的乳腺癌細胞株耐受，使用納摩爾級的治

5、療濃度，在SM-164耐受(SK-BR-3)和敏感(MDA-MB-468)的細胞株都發(fā)現(xiàn)放射增敏作用，SER分別為1.70和1.81。正常乳腺上皮細胞MCF-10A不表達cIAP-1，SM-164對其無明顯的細胞毒性。(2)SK-BR-3和MDA-MB-468細胞在接受SM-164和X射線聯(lián)合治療后，出現(xiàn)皺縮、分離、脫落等凋亡形態(tài)學變化；FACS分析顯示凋亡細胞有明顯增加(P<0.05)；DNA梯度分析顯示，在SM-164耐受的SK-B

6、R-3細胞，典型的180-bp的DNA片段顯著出現(xiàn)在聯(lián)合治療組；在SM-164敏感的MDA-MB-468細胞，SM-164引起可觀的DNA片段，且在聯(lián)合射線治療后進一步增加；活性PARP和活性caspase-3蛋白表達顯示二者被大量的激活；這些結果強烈支持SM-164的放射增敏是由于促進凋亡形成，并且caspase激活有關。在caspase-3、-8和-9活性分析中，聯(lián)合治療引起SK-BR-3細胞出現(xiàn)以caspase-9、-3的激活(P

7、<0.01)，但caspase-8未見激活；引起MDA-MB-468細胞明顯的caspase-3、-8和-9激活(4、5和8倍，P<0.05或P<0.01)。SM-164的放射增敏在SK-BR-3細胞是通過激活caspase-9、-3，引起內(nèi)源性線粒體通路介導的凋亡；在MDA-MB-468細胞是通過激活caspase-9、-8和-3，引起內(nèi)源性線粒體和外源性死亡受體通路介導的凋亡。在兩個細胞株中，泛caspase抑制劑(z-VAD-fm

8、k)可抑制聯(lián)合治療的凋亡DNA片段形成和大部分阻斷和SM-164的放射增敏。siRNA沉默(caspase-9和caspase-3)可以阻斷SM-164增加的放射凋亡和放射增敏作用，SER從1.57降低到1.27(caspase-9)或1.23(caspase-3)；siRNA沉默caspase-8則沒有效果，SER從1.57降到1.55。
　　 結論：SM-164是一個高效、潛在的新型乳腺癌放射增敏藥物，具有較小的細胞毒性。B