IL-2錨定的Exosomes的制備及其對膀胱癌細胞的誘導殺傷效應的研究.pdf

1、目的:為提高exosomes的免疫原性,制備白細胞介素-2(interleukin-2,IL-2)錨定的膀胱移行細胞癌(transitional cell carcinomaof bladder,TCCB)T24細胞來源的exosomes(Ex/GPI-IL-2)疫苗,研究其電鏡形態(tài)、免疫分子組成及體外誘導細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxicT lymphocyte,CTL)殺傷T24細胞的效應,為膀胱移行細胞癌的免疫治療提供理論基礎

2、。
　　 方法:1.通過基因合成技術將糖基化磷脂酰肌醇(GPI)信號肽序列與人IL-2基因拼接成融合基因,構建pEGFP-N1-IL2gpi質(zhì)粒。膀胱移行細胞癌T24細胞經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和G418篩選后,分別建立穩(wěn)定表達GPI-IL-2融合蛋白和綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的細胞株T24/GPI-IL-2和T24/p,通過免疫熒光顯微技術和ELISA檢測IL-2錨定蛋白的表達；2.收集T2

3、4/GPI-IL-2、T24/p和T2448h細胞培養(yǎng)液,采用超速和蔗糖梯度密度離心法提取exosomes(EX/GPI-IL-2、Ex/p和Ex),用電鏡負染技術進行形態(tài)觀察,Western blot和ELISA方法進行分子標志檢測；3采用密度梯度離心法從正常人外周血分離單個核細胞,利用重組人粒細胞集落刺激因子(recombinant humangranulocyte macrophage colony stimulating fac

4、tor,GM-CSF)和重組人白細胞介素-4(recombinant human interleukin-4,IL-4)細胞因子聯(lián)合培養(yǎng),誘導樹突狀細胞形成,倒置顯微鏡和掃描電鏡觀察其形態(tài)。從外周血中分離T淋巴細胞,通過混合淋巴細胞反應檢測負載Ex/GPI-IL-2的DCs誘導的T淋巴細胞的增值效應,通過細胞毒實驗檢測負載Ex/GPI-IL-2的DCs誘導細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)對膀胱癌

5、細胞T24、BIU-87和腎癌細胞RC-2細胞的殺傷效應。
　　 結果:1.成功構建重組質(zhì)粒pEGFP-N1-IL2gpi,經(jīng)過酶切和DNA測序鑒定與預期結果一致,經(jīng)過轉(zhuǎn)染和篩選后的細胞株穩(wěn)定表達GPI-IL-2蛋白和綠色熒光蛋白；2.通過超速和蔗糖梯度密度離心法,分別從T24/GPI-IL-2、T24/p和T24細胞培養(yǎng)液中成功的提取了Ex/GPI-IL-2、Ex/p和Ex,均為直徑約30～90nm的類圓碟形小囊泡,均表達細胞

6、間粘附分子(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)、熱休克蛋白70(heat shock protein70,HSPT0)和黑色素瘤相關抗原A1(melanoma antigen family A member-1,MAGE-1)等,三種蛋白表達量沒有明顯的差異,通過ELISA檢測到基因GPI-IL-2修飾的T24細胞來源的exosomes表達錨定狀態(tài)的IL-2；3.外周血單個核細胞中的貼壁細

7、胞在細胞因子GM-CSF和IL-4的作用下,誘導出具有典型樹枝狀突起的DCs細胞。Ex/GPI-IL-2、Ex/p和Ex經(jīng)過DCs細胞負載后,誘導T細胞的增值指數(shù)分別為2.78±0.25,1.94±0.32和1.92±0.28,分別活化的CTL在效靶比為50:1時,對T24細胞的殺傷率分別為:53.01±2.25％,37.22±2.49％和37.85±1.57％,相應的CTL釋放的INF-γ分別為:1054.82±35.20pg/ml,

8、678.02±17.97pg/ml,和683.23±13.99pg/ml,Ex/GPI-IL-2活化的CTL對膀胱癌細胞T24、BIU-87和腎癌細胞RC-2的殺傷率分別為:53.01±2.25％、46.61±2.60％、31.38±2.33％。
　　 結論:膀胱移行細胞癌T24可以向細胞外釋放exosomes,含有腫瘤抗原MAGE-1和免疫相關蛋白HSP70、ICAM-1等；通過基因轉(zhuǎn)染技術,可以將IL-2錨定到T24細胞來源