老年性癡呆（阿爾茨海默?。│碌矸蹣拥鞍兹嗽纯贵w的體外篩選和表達.pdf

1、中國協(xié)和醫(yī)科大學博士學位論文老年性癡呆（阿爾蔣海默?。│碌矸蹣拥鞍兹嗽纯贵w的體外篩選和表達姓名：蔡炯申請學位級別：博士專業(yè)：核醫(yī)學與影像醫(yī)學指導教師：王世真2003.1.1中固拂和醫(yī)科人學博∽i】I_究生論文3洗脫。SDS—PAGE和考馬斯亮藍染色實驗表明，從表達細菌的超聲上清液中純化得到分子量大小不等的5條帶，沉淀中純化得到一條帶。WesternBlot證實，從細菌不溶性沉淀中純化得到的純度較高的約32Kda的蛋白質(zhì)為我們表達得到的A

2、040的單鏈抗體，并帶有His6和cmyctag。而上清液中純化得到的單鏈抗體已經(jīng)被降解。用c—myc的單克隆抗體進行單鏈抗體的抗原結(jié)合能力進行分析，El。ISA測試證實從細菌不溶性沉淀中純化得到的純度較高的單鏈抗體保持了結(jié)合AB40的生物活性。將單鏈抗體基因克隆插入酵母表達質(zhì)粒pPIC9K，電穿孔法轉(zhuǎn)化KM71和GSll5酵母細胞系，共得到81個克隆。通過甲醇誘導，對其中78個克隆進行了表達。卜清液的SDS—PAGE和銀染分析，確定其

3、中的6個克隆在誘導的第6天分泌了單鏈抗體。對這六個克隆進行抗體分泌時間的分析，發(fā)現(xiàn)抗體在誘導后的72小時左右分泌量達到最高。本項研究的另一個目的是獲得適合于l臨床治療研究應(yīng)用的老年性癡呆抗體藥物。將單鏈抗體基因的重鏈區(qū)域和輕鏈區(qū)域分別擴增，最后先后分別插入昆蟲桿狀病毒重組表達系統(tǒng)pPAC—L—CH3中，和野生的線性化的昆蟲病毒DNA共轉(zhuǎn)染昆蟲細胞SF9。通過熒光免疫分析表明在轉(zhuǎn)染后的6天，完整的人的單克隆抗體從昆蟲細胞向培養(yǎng)基中分泌。關(guān)