應(yīng)用基因芯片篩選β淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的阿爾茨海默病細(xì)胞模型差異表達(dá)基因.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer'sdisease，AD)是一種進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)退變疾病，是老年人癡呆的主要原因，主要臨床表現(xiàn)為記憶力障礙、持續(xù)性智能衰退、判斷推理能力喪失、運(yùn)動(dòng)障礙等。隨著社會(huì)老齡化趨勢(shì)日漸加重，AD已經(jīng)成為繼心臟病、癌癥、腦血管病之后人類死亡的第四大病因。AD的主要病理改變是老年斑、神經(jīng)纖維纏結(jié)、區(qū)域性神經(jīng)元喪失。β-淀粉樣蛋白(Aβ)是老年斑核心的主要成份，被認(rèn)為在阿爾茨海默病形成中起重要作用。Aβ介導(dǎo)的AD發(fā)病機(jī)制

2、非常復(fù)雜，涉及到基因突變、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫炎癥等多種生物學(xué)過程。 為了研究AD的發(fā)病機(jī)制，我們加入凝聚態(tài)的Aβ25-35誘導(dǎo)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞系，模擬AD損傷，構(gòu)建AD細(xì)胞模型。以MTT法測(cè)定SH-SY5Y細(xì)胞在不同濃度Aβ25-35處理下細(xì)胞生存率的變化，光鏡及電鏡下觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA片斷化情況，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率的變化。根據(jù)凋亡率、生存率及細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化等，

3、確定以10μ/LAβ25-35誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞48小時(shí)，應(yīng)用安捷倫人全基因組表達(dá)譜基因芯片(AgilentHuman1Boligomicroarray)篩選該模型與未經(jīng)誘導(dǎo)的對(duì)照細(xì)胞間差異表達(dá)基因，分析差異基因的功能及與AD相關(guān)性。 目標(biāo)：篩選Aβ誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞模型的差異表達(dá)基因，分析差異表達(dá)基因與AD發(fā)病機(jī)制的相關(guān)性，在基因水平研究阿爾茨海默病發(fā)病的分子機(jī)制。 方法： 1.構(gòu)建阿爾茨海默病細(xì)胞模

4、型： (1)培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞(1640培養(yǎng)基，15％FBS，37℃，05％CO2)。 (2)加入Aβ25-35進(jìn)行誘導(dǎo)，作用濃度分別為0.1、1、10、20μmol/L，MTT法檢測(cè)細(xì)胞生存率。 (3)1.5％凝膠電泳檢測(cè)凋亡細(xì)胞的片斷化DNA，并在光鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化。 (4)透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞是否出現(xiàn)明顯凋亡特征。 (5)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率變化，Aβ25-35作用濃度分別

5、為O、1、5、10、20μmol/L. 2.篩選AD模型中差異表達(dá)基因并研究其與AD發(fā)病機(jī)制的相關(guān)性： (1)培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80％時(shí)平均分為兩組，一組作為對(duì)照組不加Aβ25-35處理，另一組10μmol/LAβ25-35誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。采用RNeasyMiniKit(QIAGEN公司)分別提取兩組的總RNA。 (2)應(yīng)用Agilent2100Bioanalyzer分析總RNA質(zhì)量。

6、 (3)RNA樣品的標(biāo)記(線性擴(kuò)增法進(jìn)行熒光標(biāo)記，對(duì)照組標(biāo)記Cy3-dCTP，處理組標(biāo)記Cy5-dCTP)、與AgilentHuman1B芯片的雜交及清洗均按芯片配套試劑盒的說明進(jìn)行。 (4)用Agilent2565基因芯片掃描儀掃描，得到芯片雜交結(jié)果。 (5)分析基因芯片數(shù)據(jù)，以P-Value≤0.01作為差異表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)，以Cy5(rprocessedsignals)/Cy3(gprocessedsignals

7、)≥2作為表達(dá)上調(diào)的標(biāo)準(zhǔn)，Cy5/Cy3≤0.5作為表達(dá)下調(diào)的標(biāo)準(zhǔn)。 (6)差異表達(dá)基因在Panther數(shù)據(jù)庫(www.pantherdb.org)進(jìn)行分類。 結(jié)果： 1.對(duì)照組及Aβ25-35濃度依次是0.1、1、10、20μmol/L的處理組經(jīng)MTT法檢測(cè)，OD570分別是0.3167±0.0153、0.3100±0.0100、0.2433±0.0116、0.1933±0.0058、0.1467±0.0252

8、。其中0.1umol/L處理組與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，其他處理組有顯著差異(P＜0.01)。細(xì)胞存活率隨Aβ25-35濃度升高而降低。 2.對(duì)照組及Aβ25-35作用濃度為1.0、5.0、10.0、20.0μmol/L時(shí)的細(xì)胞凋亡率分別是7.4％、15.6％、23.5％、27.1％、32.4％。 3.通過電鏡、光鏡觀察到處理組細(xì)胞出現(xiàn)顯著凋亡特征。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)到片斷化的DNA所形成的梯狀條帶。

9、 4.篩選出1201個(gè)差異表達(dá)基因，其中411表達(dá)上調(diào)，790個(gè)表達(dá)下調(diào)，其中16個(gè)與AD密切相關(guān)基因分別涉及細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞骨架形成等。 結(jié)論： Aβ25-35誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞成功構(gòu)建AD細(xì)胞模型。實(shí)驗(yàn)證明Aβ25-35可以引起細(xì)胞生存率下降，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。經(jīng)過表達(dá)譜基因芯片分析該細(xì)胞模型中差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)這些基因與產(chǎn)生AD的生物學(xué)過程密切相關(guān)，主要涉及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、DNA\RNA\蛋