阿爾茨海默病鼠模型(DKO mice)中期海馬DNA甲基化致病基因的篩選研究.pdf

1、目的:阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和記憶力損害為主要表現(xiàn)。發(fā)病率較高,是老年癡呆最常見的一種類型,其病理變化主要表現(xiàn)為廣泛神經(jīng)元喪失、大腦皮層萎縮及海馬出現(xiàn)典型的老年斑(senile plaques,SP)、淀粉樣蛋白(β-amyloid protein，Aβ)沉積、神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles, NFT)及Tau蛋白過度

2、磷酸化等。其臨床癥狀主要包括逐漸出現(xiàn)的記憶力減退、認(rèn)知功能障礙、人格改變及晚期機體功能障礙等，疾病逐漸進(jìn)展惡化,嚴(yán)重者可累及生命。然而，遺憾的是其發(fā)病機制至今尚未完全清楚。過去多著重于對 DNA序列本身的研究，而有些疾病的發(fā)生和和表型的出現(xiàn)并不僅僅是 DNA序列的改變。曾有學(xué)者對3對同卵雙生的家族性阿爾茨海默病(FAD)患者進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)即使具有完全相同基因組的兩個孿生子，發(fā)病年齡、臨床癥狀都不完全相同。這說明在相應(yīng)的基因堿基序列沒有發(fā)

3、生變化的情況下,一些生物體的表型卻發(fā)生了改變。
　　近年來,隨著 DNA甲基化研究的不斷深入,發(fā)現(xiàn)與 AD密切相關(guān)基因如淀粉樣蛋白前體基因(APP)、載脂蛋白 E基因(Apoe-4)、早老素1基因(Psen-1)和早老素2基因(Psen-2)均發(fā)生了異常甲基化改變。所以 DNA甲基化對 AD相關(guān)基因的調(diào)控也成為近年來研究的熱點,尤其在基因表達(dá)的調(diào)控方面和維持正常細(xì)胞功能方面起著重要作用,其通過改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定

4、性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式等來控制基因表達(dá)狀態(tài)。該研究前期成功飼養(yǎng)和繁殖早期cDKO mice阿爾茨海默病模型；獲得30個甲基化異常基因。那么,隨著年齡的增長是不是還有更多的異常甲基化基因參與到AD發(fā)病機制中呢，這些基因是否有重疊？本實驗首先繁育及篩選出中期PS1/PS2雙基因敲除阿爾茨海默病鼠模型,該小鼠表現(xiàn)出類似于中期AD的部分神經(jīng)退行性病變,如淀粉樣血管變形、經(jīng)典型老年斑、腦皮質(zhì)大部分萎縮、大部分神經(jīng)元丟失以及漸進(jìn)性認(rèn)知功能等

5、障礙等,符合中期AD動物模型的要求；通過基因檢測技術(shù)對中期阿爾茨海默病鼠模型海馬組織中DNA甲基化變化進(jìn)行檢測分析,以獲更多與中期AD密切相關(guān)的異常甲基化致病基因。方法:實驗選取野生型及 PS1/PS2雙基因敲除同系小鼠進(jìn)行飼養(yǎng)和繁殖，將子代雜合子小鼠進(jìn)行交配,提取子代小鼠鼠尾基因組DNA,采用PCR法和瓊脂糖凝膠電泳鑒定其基因類型。實驗分別選取性別、年齡匹配的12月齡cDKO mice與野生型小鼠各3只,提取海馬組織基因組DNA;運用

6、表觀亞硫酸鹽測序技術(shù)(Reduced Representation Bisulphite Sequencing,RRBS)檢測基因組 DNA異常甲基化分布及其類型,利用Bismark(vO.7.4)軟件與小鼠參考基因組序列進(jìn)行比對獲得甲基化異?；虿⑦M(jìn)行差異甲基化區(qū)域(DMR)分析，運用DAVID在線分析網(wǎng)站進(jìn)行功能基因的GO與KEGG功能分析。結(jié)果：本實驗成功飼養(yǎng)和繁殖了PS1/PS2雙基因敲除中期阿爾茨海默病鼠模型。利用Bismar

7、k(vO.7.4)軟件與小鼠參考基因組序列進(jìn)行比對,進(jìn)行差異甲基化區(qū)域(DMR)分析,獲得127個甲基化異常基因,在不同染色體上分析獲得異常甲基化位點3025個,涉及2758個基因,運用DAVID在線分析網(wǎng)站GO與KEGG數(shù)據(jù)庫對異常甲基化基因進(jìn)行在線分析,初步對它們的功能有了一定的了解。結(jié)論：正確的飼養(yǎng)繁殖及鑒定方法是獲得cDKO mice的有效途徑。本研究通過RRBS篩選出中期阿爾茨海默病鼠模型異常甲基化致病基因,并發(fā)現(xiàn)了與AD相關(guān)