早期阿爾茨海默病鼠模型(preseniliN-1-preseniliN-2雙基因敲除小鼠)海馬中甲基化致病基因的篩選研究.pdf

1、目的:阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)的病理特征主要表現(xiàn)為大腦特定區(qū)域神經(jīng)元退行性病變，尤其在海馬、大腦皮層等區(qū)域。其臨床表現(xiàn)主要是從初期的學(xué)習(xí)記憶障礙，認(rèn)知功能障礙，到晚期的癡呆癥候群。雖然關(guān)于AD的發(fā)病機(jī)制存在諸多假說，如膽堿能神經(jīng)元假說、Aβ毒性假說、Tau蛋白假說、胰島素假說、自由基損傷假說、基因變異假說等，但是其具體致病機(jī)制尚未完全研究清楚。近年來，大量研究表明基因異常甲基化與AD緊密相關(guān)，如早發(fā)性

2、家族性阿爾茨海默病(early-onset familial Alzheimer'sdisease，F(xiàn)AD)中存在早老素(Presenilins)基因及淀粉樣前體蛋白(APP)基因的甲基化異常，是其FAD早期發(fā)病的原因之一。presenilin-1/presenilin-2(PS1/PS2)基因可編碼高度同源的跨膜蛋白γ-分泌酶，該酶參與淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)合成后加工及轉(zhuǎn)運(yùn)，從而影

3、響β淀粉樣蛋白(amyloid peptide，Aβ)的形成，其變異可加速Aβ的產(chǎn)生和沉積，而Aβ的過量產(chǎn)生和積聚可導(dǎo)致神經(jīng)元軸突的損傷及神經(jīng)死亡，從而引起AD發(fā)生。在晚發(fā)散發(fā)性阿爾茨海默病(late-onset Alzheimer's disease，LOAD)中也發(fā)現(xiàn)如TMEM59和SORL1基因啟動(dòng)子區(qū)域及Apoe基因存在異常甲基化改變的現(xiàn)象。為探討是否還存在其它甲基化異常基因參與到AD，尤其是早期AD的發(fā)病機(jī)制中，本實(shí)驗(yàn)首先繁育

4、及篩選出阿爾茨海默病小鼠模型，即條件性presenilin-1/presenilin-2雙基因敲除小鼠(dKO mice)，作為本研究的實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖?，該小?月齡時(shí)表現(xiàn)出類似于早期AD的部分神經(jīng)退行性病變，如輕度皮質(zhì)萎縮、神經(jīng)元凋亡及tau-蛋白磷酸化以及輕度認(rèn)知功能障礙等，符合早期AD動(dòng)物模型的要求;然后再通過基因測(cè)序技術(shù)分析早期AD海馬組織中DNA甲基化變化情況，以獲取更多的與早期AD相關(guān)的甲基化異常基因。
　　方法:選取野生型

5、及PS1/PS2雙基因敲除同系小鼠進(jìn)行飼養(yǎng)并繁殖，再將子代雜合子小鼠進(jìn)行交配，并通過提取子代小鼠鼠尾基因組DNA，采用PCR法和瓊脂糖凝膠電泳鑒定基因類型。實(shí)驗(yàn)分別選取3只7月齡dKO mice及3只7月齡野生型小鼠，提取海馬組織基因組DNA，運(yùn)用簡(jiǎn)化的表觀亞硫酸鹽測(cè)序技術(shù)（Reduced Representation Bisulphite Sequencing，RRBS）檢測(cè)基因組DNA異常甲基化分布及類型，利用相關(guān)生物軟件對(duì)照分析以

6、獲得異常甲基化基因，并進(jìn)行在線功能分析。
　　結(jié)果:本實(shí)驗(yàn)成功飼養(yǎng)和繁殖PS1/PS2雙基因敲除早期阿爾茨海默病模型小鼠。利用Bismark(vO.7.4)軟件與野生小鼠參考基因組序列進(jìn)行比對(duì)，運(yùn)用DAVID在線分析網(wǎng)站進(jìn)行功能基因的GO與KEGG功能分析及差異甲基化區(qū)域(DMR)分析，獲得30個(gè)甲基化異?；?，在不同的染色體上分析獲得異常甲基化位點(diǎn)1338個(gè)，涉及873個(gè)基因。
　　結(jié)論:使用正確的飼養(yǎng)繁育以及鑒定方法是獲