研究阿爾茨海默病多個(gè)候選基因的DNA甲基化機(jī)制及功能研究.pdf

1、目的：本研究主要通過檢測病例對照組外周血中阿爾茨海默?。ˋD）易感基因的DNA甲基化水平差異，以及所檢測區(qū)域?qū)虮磉_(dá)功能的影響，從而探究 DNA甲基化水平的改變和 AD之間的關(guān)系。
　　方法：收集血液樣本共108例，其中包含確診 AD患者44例和正常對照62例，通過焦磷酸測序的方法對 BDNF、DRD4、OPRD1、OPRM1、OPRK1、OPRL1、GPR50和 DISC1基因的啟動(dòng)子區(qū)域 CpG島進(jìn)行甲基化水平的檢測；同時(shí)收

2、集參與者的表型信息用于后期的相關(guān)性分析。通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證被測片段是否具有調(diào)節(jié)基因表達(dá)的功能。
　　結(jié)果：1） AD組中 BDNF甲基化率顯著高于正常對照組（CpG1：p=0.021；CpG2：p=0.002；CpG3：p=0.007；CpG4：p=0.005；平均甲基化水平：p=0.004）。性別分層后，發(fā)現(xiàn) CpG2位點(diǎn)甲基化率在男性 AD患者中顯著高于男性對照組（p=0.018），CpG4甲基化率在女性患者中顯著

3、高于女性對照組（p=0.039）。另外，用藥和 BDNF甲基化率之間無顯著相關(guān)性（p>0.05）。2）在總樣本和男性樣本中，AD患者的甲基化水平顯著高出正常對照（總體：p=4.69E-5，男性：p=9.17E-05，女性：p=0.080）。服用艾斯能藥物的患者相較安理申使用者 CpG3位點(diǎn)甲基化率高（p=0.044）。在男性中發(fā)現(xiàn)，DRD4甲基化率和 ApoA及 CRP水平顯著相關(guān)（ApoA：p=0.042； CRP：p=4.06E-5

4、）。女性中發(fā)現(xiàn)，DRD4基因甲基化率和 ApoA，CRE及 CRP水平顯著相關(guān)（ApoA：p=3.65E-05；CRE：p=0.045；CRP：p=0.041）.3）AD患者 OPRD1 CpG3位點(diǎn)的甲基化程度均顯著高于正常對照（CpG1：p=0.052；CpG2：p=0.094； CpG3：p=1.68E-7）。我們的研究發(fā)現(xiàn)在女性對照組中CpG3位點(diǎn)甲基化率和 HDL-C呈正相關(guān)（p=0.033），在女性病例組中和磷離子濃度呈正相

5、關(guān)（p=0.020）。另外，該位點(diǎn)甲基化率和 ALP水平在所有對照中顯著負(fù)相關(guān)（p=0.009）。在 AD組中，磷離子和 CpG3位點(diǎn)甲基化率在總樣本中呈正相關(guān)（p=0.001）。年齡也是 AD非常重要的一個(gè)影響因素，我們研究發(fā)現(xiàn) OPRD1 CpG1甲基化水平和年齡在女性 AD患者中呈正相關(guān)性（r=0.434，p=0.034）。后期的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)插入的OPRD1啟動(dòng)子區(qū)域片段具有增強(qiáng)下游基因表達(dá)的功能（fold=2.2，p=0.01）

6、。4）與正常對照相比，OPRM1甲基化程度在總樣本和男性 AD患者中顯著增高（總體：p=0.11；男性：p=0.039）。此外，年齡和 OPRM1甲基化程度在正常對照和女性對照組中均呈正相關(guān)（總體對照：r=0.326，p=0.009；女性對照：r=0.641，p=0.006）。后期的熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示插入片段具有增強(qiáng)下游基因表達(dá)的功能（p=0.003）。5） OPRK1甲基化水平在 AD組中顯著高于對照組（CpG1：p=3.22E

7、-04；CpG2：p=0.006；CpG3：p=0.029；平均甲基化水平：p=0.006）。年齡和甲基化水平呈正相關(guān)（p=0.041）。進(jìn)一步的分組分析發(fā)現(xiàn)，年齡和該基因甲基化水平在 AD組中沒有顯著相關(guān)性，但是在對照組中呈正相關(guān)（病例組：p=0.999；對照組：p=0.003）。在女性人群中，該基因和TBIL、DBIL、IBIL和 ALT均呈負(fù)相關(guān)（TBIL：p=0.012； DBIL：p=0.011； IBIL：p=0.025；

8、ALT：p=0.026）。將 OPRK1目的片段插入 pGL3-basic載體，發(fā)現(xiàn)該片段具有上調(diào)下游基因表達(dá)的功能（fold=2.248，p=0.0235）。6） OPRL1基因的四個(gè) CpG位點(diǎn)在 AD患者中都顯著性增高（CpG1：p=4.43E-05，CpG2：p=8.56E-05，CpG3：p=1.70E-06，CpG4：p=0.031）。7）男性 AD患者的GPR50甲基化程度顯著低于正常男性（p=0.002）。該基因甲基化水

9、平性別差異顯著，無論是在 AD患者中還是正常人群中，在女性中的甲基化程度均顯著高于男性（病例組：p=2.26E-09，對照組：p=1.10E-04）。同時(shí)，在男性中，脂蛋白 A及鎂離子和甲基化程度具有顯著的相關(guān)性（r=-0.322，p=0.031），而在女性中發(fā)現(xiàn)，鈉離子和甲基化程度呈正相關(guān)（r=0.478，p=0.002）。另外鎂離子濃度和甲基化水平在男性中呈負(fù)相關(guān)（r=-0.406，p=0.005）。8）DISC1甲基化程度在 AD