CR1基因與阿爾茨海默病的關(guān)聯(lián)分析及機(jī)制研究.pdf

1、阿爾茨海默病(alzheimer disease，AD)是最常見(jiàn)的癡呆類(lèi)型之一，在全球范圍內(nèi)已有超過(guò)3500多萬(wàn)的患者，并且這個(gè)數(shù)據(jù)到2030年將增加到6500萬(wàn)。AD是多因素疾病，其影響因素包括年齡，家族史和基因因素等。其中基因因素已經(jīng)被證實(shí)在晚發(fā)性AD中遺傳度可達(dá)60％到80％。根據(jù)AD基因數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.alzgene.org/)顯示，補(bǔ)體成分(3b/4b)受體1基因(complement receptor1，CR1

2、)被認(rèn)為是與AD密切相關(guān)的基因之一。隨著Lambert團(tuán)隊(duì)首次證實(shí)CR1基因的基因多態(tài)性與AD易感性相關(guān)，不久全球的研究者陸續(xù)發(fā)現(xiàn)CRI基因在多地區(qū)多種族中與AD易感性相關(guān)。
　　考慮到CR1基因和AD易感性密切相關(guān)，揭示CR1基因多態(tài)性與AD的病理關(guān)聯(lián)以及CR1基因在AD病理中的具體作用變得尤為重要。到目前為止，現(xiàn)有的研究主要揭示了CR1基因通過(guò)調(diào)節(jié)淀粉樣蛋白(amyloidβ，Aβ)的代謝影響AD的病理，很少有研究探索CRI基

3、因的基因變異與AD其他病理變化之間的關(guān)系。因而，在本研究的第一部分中，我們使用神經(jīng)影像學(xué)手段和腦脊液(cerebrospinalfluid，CSF)蛋白標(biāo)記物檢測(cè)CR1基因的基因變異與AD病理表型的關(guān)系，例如使用影像學(xué)檢測(cè)方法檢測(cè)Aβ在大腦中的沉積，腦萎縮和大腦糖代謝情況，檢測(cè)CSF中的A342含量，總tau蛋白(total tau，t-tau)和過(guò)度磷酸化的tau(hyperphosphorylatedtau，p-tau)蛋白情況，從

4、而發(fā)現(xiàn)診斷AD的有效手段。由于tau病理是AD的另一個(gè)重要病理特征，因而揭示CR1基因在AD相關(guān)的tau病變的生物學(xué)機(jī)制將更有意義。Cr1-相關(guān)蛋白Y基因(Cr1-related protein Y，Crry)，一種嚙齒類(lèi)動(dòng)物特有的基因，編碼一種重要的細(xì)胞表面的補(bǔ)體調(diào)節(jié)受體，該Crry蛋白與人類(lèi)CR1蛋白有較高的組織結(jié)構(gòu)和功能，并且這兩個(gè)基因的位置具有序列同源性，因此人類(lèi)的CRI基因被認(rèn)為是從Crry基因演變而來(lái)?？紤]到這些證據(jù)，嚙齒類(lèi)

5、動(dòng)物中的Crry基因已經(jīng)被廣泛接受成為研究人類(lèi)的CR1基因的替代。在本研究的第二部分，我們擬利用轉(zhuǎn)基因小鼠動(dòng)物模型，結(jié)合慢病毒為載體的基因沉默技術(shù)，我們通過(guò)使用小鼠模型中的Crry基因來(lái)探索人類(lèi)CR1基因在AD相關(guān)的tau病變的具體機(jī)制。
　　綜上所述，本課題完成不僅能為AD的早期診斷提供有力支持，而且能進(jìn)一步全面揭示CR1基因參與AD的具體機(jī)制，從而為AD的預(yù)防與治療提供新的方向。
　　第一部分 CR1基因多態(tài)性與AD患者

6、的神經(jīng)影像標(biāo)志物和腦脊液蛋白之間關(guān)系的研究
　　目的:本研究首次探討CR1基因多態(tài)性與AD相關(guān)的神經(jīng)影像標(biāo)志物和腦脊液蛋白之間的聯(lián)系。
　　方法:本研究中納入了阿爾茨海默病神經(jīng)影像行動(dòng)計(jì)劃的（Alzheimer，s DiseaseNeuroimaging Initiative，ADNI）的812人，分別為48名AD患者，483名輕度認(rèn)知功能障礙患者（mild cognitive impairment，MCI）和281名正常對(duì)

7、照者(normalcontrol，NC)。納入了8個(gè)由全基因組關(guān)聯(lián)研究(Genome-wide association study，GWAS)研究，大型的病例對(duì)照研究或者其他實(shí)驗(yàn)性文章驗(yàn)證過(guò)的并且ADNI數(shù)據(jù)庫(kù)存在CR1基因的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點(diǎn)(rs10779339，rs12034383，rs2025935，rs3737002，rs3838361，rs4844609

8、,rs4844610和rs6691117)。本課題中使用AV45-PET檢測(cè)腦淀粉樣蛋白成像，MRI檢測(cè)大腦的體積，PET檢驗(yàn)?zāi)X中糖代謝速率。使用xMAP Luminex試劑盒（Luminex Corp，Austin，TX）和免疫分析試劑盒（INNO-BIA AlzBio3;Ghent，Belgium; for research use-only reagents）測(cè)定腦脊液中Aβ42，t-tau和p-tau的濃度。
　　結(jié)果:我

9、們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)rs4844609位點(diǎn)的突變?cè)黾涌蹘Щ?，額葉，頂葉和顳葉的淀粉樣蛋白的沉積，并且主要影響MCI和NC組人群;rs12034383的突變與左側(cè)及右側(cè)的中顳葉區(qū)域的體積成負(fù)相關(guān)，而在rs3737002的突變與左側(cè)及右側(cè)的中顳葉區(qū)域的體積成正相關(guān)，在rs669117的突變確認(rèn)為與左側(cè)的中顳葉體積成負(fù)相關(guān);rs10779339的突變的能夠有效減少右側(cè)顳回的糖代謝，并且主要影響AD和MCI人群;納入的CR1基因的基因突變與腦脊液中

10、的Aβ42，total-tau和p-tau沒(méi)有關(guān)聯(lián)。
　　結(jié)論:本研究首次提示CR1基因的基因多態(tài)性與Aβ在大腦中的沉積，大腦相關(guān)結(jié)構(gòu)的體積，以及糖代謝之間存在緊密的聯(lián)系。
　　第二部分 CR1參與AD的tau病理進(jìn)程的生物學(xué)機(jī)制研究
　　目的:調(diào)控小鼠模型中的Crry基因來(lái)探索人類(lèi)CR1基因在AD相關(guān)的tau病變的具體機(jī)制。
　　方法:選用6月齡P301S轉(zhuǎn)基因小鼠及野生型小鼠，構(gòu)建包裹小鼠野生型CrryshR

11、NA的慢病毒載體，下調(diào)小鼠腦中的Crry蛋白的表達(dá)量。2個(gè)月后通過(guò)Westernblot法或者免疫組化染色法檢測(cè)腦中過(guò)度磷酸化tau蛋白，tau激酶，tau磷酸酶和補(bǔ)體系統(tǒng)相關(guān)蛋白濃度;使用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)定下調(diào)Crry蛋白后對(duì)小鼠空間學(xué)習(xí)及記憶能力;使用qRT-PCR法測(cè)定下調(diào)Crry蛋白后大腦中神經(jīng)炎癥介質(zhì)的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:Crry蛋白在AD環(huán)境下隨著衰老進(jìn)程其表達(dá)量增加，使用Crry shRNA能夠有效的減少P