微透析法進行鬼臼毒素固體脂質(zhì)納米粒凝膠經(jīng)皮藥代動力學(xué)研究.pdf

1、背景
　　 鬼臼毒素(Podophyllotoxin,PPT)是從小蘗科鬼臼屬植物中提取的一種具有顯著細胞毒性的天然活性物質(zhì)。0.5％ PPT酊劑是WHO推薦治療尖銳濕疣(condyloma acuminatum,CA)一線藥物之一。但PPT酊劑在皮膚局部停留時間短,藥物濃度很快下降,并且對局部組織具有較強的刺激性,易引起皮膚潰爛等不良反應(yīng),當(dāng)大面積使用時易產(chǎn)生系統(tǒng)吸收毒性。固體脂質(zhì)納米粒(solid lipidnanopart

2、icles,SLN)是近年皮膚靶向性藥物載體研究的熱點,被認(rèn)為是可替代脂質(zhì)體的新一代藥物載體。SLN制劑具有生理相容性好、可控制藥物釋放、良好的靶向性、可避免化學(xué)不穩(wěn)定性藥物的降解和減少藥物對皮膚的刺激作用等多項優(yōu)點。因此,SLN作為藥物載體應(yīng)用于經(jīng)皮給藥系統(tǒng)具有良好的發(fā)展前景。為了增加PPT。在皮膚中的滯留量,增強其對病變組織的靶向作用,延長其對病變細胞的作用時間,達到提高CA的治療效果同時又盡可能降低其局部和全身毒副作用的目的,我們

3、以毒性低、生物相容性好的固體脂質(zhì)材料-硬脂酸、十八烷酰胺為藥物載體吸附或包裹PPT,以Brij78和大豆卵磷脂為混合表面活性劑,采用改良的乳化蒸發(fā)-低溫固化法制備了鬼臼毒素固體脂質(zhì)納米粒(PPT-SLN)混懸液。凝膠具有很多優(yōu)點,如良好的生物黏附作用；充分的三維空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),可均勻分散固體脂質(zhì)納米?；鞈乙?進一步鞏固穩(wěn)定性；能夠起到緩釋長效目的等。所以我們進一步制備了鬼臼毒素-固體脂質(zhì)納米粒凝膠。為了證明鬼臼毒素固體脂質(zhì)納米粒凝膠的優(yōu)越

4、性,我們用傳統(tǒng)的鬼臼毒素酊劑進行比較。
　　 皮膚病的治療要求藥物在皮損局部靶組織發(fā)揮作用,因此檢測皮損內(nèi)的藥物濃度顯得尤為重要。皮損內(nèi)藥物濃度不僅是皮損局部藥效作用重要的定量指標(biāo),而且是進行皮膚藥代動力學(xué)研究的關(guān)鍵參數(shù)。長久以來,外用制劑的皮膚內(nèi)濃度檢測因受到研究方法和分析設(shè)備的限制,應(yīng)用和研究現(xiàn)狀顯得十分滯后。目前常用的評價藥物透皮吸收的方法還是經(jīng)典的兩室Franz擴散方法,所用材料為離體動物/人體皮膚或人工膜。雖然Fran

5、z擴散池法在前期預(yù)測藥物生物利用度或等效性方面不失為一種有效的方法,但是該方法還是有很多不足之處。其中最關(guān)鍵的是沒有考慮到體內(nèi)的血管系統(tǒng)、代謝酶及離體皮膚水分的丟失等問題。因此體外透皮研究結(jié)果不能準(zhǔn)確反映藥物在皮膚中的吸收、分布、代謝、轉(zhuǎn)歸等局部藥代動力學(xué)過程。常用的體內(nèi)評價藥物經(jīng)皮吸收方法,包括膠帶剝離法、示蹤技術(shù)、吸皰實驗、皮膚活檢等,不是特異性不高就是具有創(chuàng)傷性,未能達到微創(chuàng)、實時、精確定位等要求。
　　 微透析(micr

6、odialysis,MD)是一種從生物活體內(nèi)進行動態(tài)微量生化取樣的新技術(shù)。可以用于在體監(jiān)測外源性物質(zhì)或內(nèi)源性物質(zhì)在組織細胞外液濃度隨時間動態(tài)變化的過程。它以透析原理作為取樣的基礎(chǔ),模擬了毛細血管能夠容許細胞內(nèi)外液物質(zhì)自由擴散的功能。由于具有活體連續(xù)取樣、動態(tài)觀察、定量分析、采樣量小、組織損傷輕等特點,最近十幾年來微透析技術(shù)在評價藥物經(jīng)皮代謝中受到廣泛關(guān)注。經(jīng)皮微透析可以對實驗動物或人體皮膚組織進行在體、連續(xù)的藥物濃度測定,使得在體研究外

7、用制劑的經(jīng)皮吸收動力學(xué)和生物等效性成為可能。皮膚藥物代謝動力學(xué)的深入研究會有助于改善藥物治療方案,開發(fā)藥物新劑型。另外,經(jīng)皮給藥后,藥物可經(jīng)皮吸收入血,利用血液微透析技術(shù)可以進一步評價外用藥物系統(tǒng)吸收毒性。微透析取樣的樣品濃度低、樣品體積小,因此微透析采樣技術(shù)的可行性實質(zhì)上依賴于檢測儀器的選擇,只要檢測手段的靈敏度足夠高,采用微透析技術(shù)是完全可行的。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography tandem mass s

8、pectrometry,LC-MS/MS)方法具有靈敏度高、特異性強、樣品量需求少、分析速度快的特點,其與微透析聯(lián)用對生物活體的在線研究有不可替代的作用。因此,LC-MS/MS與微透析系統(tǒng)聯(lián)用已經(jīng)成為生物化學(xué)和藥代動力學(xué)研究的重要方法之一。本研究以靈敏度高、特異性強的LC-MS/MS檢測微透析樣品中鬼臼毒素濃度,并對微透析取樣過程中各種影響因素進行了考察和優(yōu)化。在此基礎(chǔ)上利用皮膚、血液同步微透析技術(shù)原位、在體、實時檢測了鬼臼毒素-固體脂

9、質(zhì)納米粒凝膠及鬼臼毒素酊劑在大鼠腹部經(jīng)皮給藥后,在大鼠皮膚、血液中鬼臼毒素濃度隨時間變化規(guī)律,并進行生物等效性評價。
　　 目的
　　 1、建立測定大鼠皮膚及血液微透析樣品中鬼臼毒素濃度LC-MS/MS法并進行方法學(xué)考察；
　　 2、考察鬼臼毒素微透析體內(nèi)外回收率及影響因素；
　　 3、考察PPT-SLN凝膠經(jīng)皮藥代謝動力學(xué)及血液中藥代動力學(xué),并與鬼臼毒素酊劑進行生物等效性評價。
　　 方法

10、>　　 1、微透析樣品中加入依托泊苷為內(nèi)標(biāo)(internal standard,IS),經(jīng)乙酸乙酯液-液提取后進行超高流速液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(ultra flow liquidchromatography tandem mass spectrometry,UFLC-MS/MS)測定。以乙腈-10mmol/L乙酸銨(40:60,v/v)為流動相,采用Agilent Zorbax XDB-C18色譜柱(2.1mm×50mm,3.5μ m)進

11、行分離,柱溫為室溫。流速為0.3mL/min；質(zhì)譜采用正離子方式檢測；掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(multi-reactions monitoring,MRM)。
　　 2、體外微透析試驗中考察灌注液灌流速度、探針周圍溶液溫度、探針周圍溶液濃度對探針相對回收率的影響,并以零凈流量法(zero net flux method,ZNF)考察了鬼臼毒素通過微透析膜是否存在擴散方向依賴性。在大鼠右頸靜脈及皮下植入探針后,以反向透析法分別測定鬼

12、臼毒素在血液中及皮下回收率。以UFLC-MS/MS法檢測微透析樣品中藥物濃度。
　　 3、8只雄性SD大鼠按完全隨機的方法均分為兩組,大鼠麻醉后,分別在腹部皮下和右頸靜脈植入微透析探針,以1ul/ml速度灌流微透析探針,平衡一個小時后,在腹部分別給予PPT-SLN凝膠或者PPT酊劑。采樣間隔時間為0.5小時,共收集10個小時。微透析樣品以乙酸乙酯液-液提取后以UFLC-MS/MS法檢測鬼臼毒素濃度。
　　 4、統(tǒng)計分析:

13、藥代動力學(xué)參數(shù)用DAS2.1.1版藥動學(xué)分析軟件處理。利用SPSS13.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,計量資料數(shù)據(jù)用(X)±S表示,兩組間均數(shù)比較采用兩獨立樣本t檢驗(Independent-Samples T Test)；分析各處理方式的主效應(yīng)及交互效應(yīng)采用重復(fù)測量的方差分析(Repeated measure)；多組組間顯著性檢驗采用單因素方差分析(One-Way ANOVA),P<0.05時差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果

14、　　 1、UFLC-MS/MS法用于定量分析的離子對分別為m/z 432.7→397.3(鬼臼毒素)和589.5→229.5(依托泊苷,IS)。標(biāo)準(zhǔn)曲線在2.0-1000ng/mL范圍內(nèi)有良好線性,相關(guān)系數(shù)均大于0.99,最低定量限(lowest limit of quantification,LLOQ)及最低檢測限(lowest limit of detection,LOD)分別為2.0ng/mL,0.7ng/mL。日內(nèi)和日間精密度

15、(RSD％)及準(zhǔn)確度(RE％)均小于10％。
　　 2、體外微透析試驗中,藥物的回收率隨灌注液流速的增大而減小,隨溫度的增加而增加,藥物回收率與周圍溶液中藥物的濃度無關(guān)。ZNF法測定藥物的回收率和傳遞率一致,回收率為47.89％；反向透析法測定皮下及血液中藥物的回收率分別為(28.46±2.42)％,(15.61±1.92)％,且在10小時內(nèi)基本穩(wěn)定。
　　 3、PPT-SLN凝膠給藥后血液微透析樣品中檢測不到藥物濃度。

16、皮膚下鬼臼毒素濃度重復(fù)測量的方差分析顯示不同藥物間的主效應(yīng)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=255.822,P=0.000),用藥后不同時間的主效應(yīng)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=85.98,P=0.000)。用藥后不同時間點與兩組藥物之間的交互效應(yīng)差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(F=14.362,P=0.000)。皮膚下鬼臼毒素濃度不同時間點PPT-SLN凝膠和PPT酊劑之間兩獨立樣品t檢驗顯示除0.5小時差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義外(t=1.794,P=0.123),其余各

17、個時間點差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),PPT酊劑組的皮膚下鬼臼毒素濃度均高于PPT-SLN凝膠組。對兩組藥物皮膚下主要藥物代謝動力學(xué)參數(shù)兩獨立樣本t檢驗示Tmax(t=2.777,P=0.032),Cmax(t=-7.806,P=0.000),AUC0-10h(t=-16.361,P=0.000),AUC0-∞(t=-4.840,P=0.003)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。PPT-SLN凝膠的皮膚下Cmax,AUC0-10h,AUC0-∞

18、均低于PPT酊劑的Cmax,AUC0-10h,AUC0-∞。PPT-SLN凝膠的皮膚下Tmax高于PPT酊劑Tmax。
　　 結(jié)論
　　 1、UFLC-MS/MS測定大鼠皮膚下及血液微透析樣品中鬼臼毒素濃度具有靈敏度高、專屬性強的特點。
　　 2、PPT通過微透析膜不存在擴散方向依賴性,反向透析法可作為體內(nèi)微透析研究中鬼臼毒素回收率的測定方法。
　　 3、鬼臼毒素-固體脂質(zhì)納米粒凝膠可對鬼臼毒素的經(jīng)皮吸收