鬼臼毒素固體脂質(zhì)納米粒的皮膚毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、尖銳濕疣(condyloma acuminatum，CA)是由人類乳頭瘤病毒(humanpapilloma virus，HPV)感染引起的臨床常見性傳播疾病，目前僅次于淋病位居我國(guó)性傳播疾病的第二位。CA具有高復(fù)發(fā)特性，且部分可轉(zhuǎn)化為鱗癌或?qū)m頸癌，因此CA已成為危害人類健康不可忽視的問題。鬼臼毒素(podophyllotoxin，PPT)是從鬼臼樹脂類木脂素中分離得到的具有顯著細(xì)胞毒性的天然活性物質(zhì)。0.5％鬼臼毒素酊劑是EtO推薦治療

2、CA最有效的一線藥物，因存在對(duì)皮膚刺激性較大、作用時(shí)間短、對(duì)HPV潛伏感染難以湊效、缺乏良好的皮膚靶向性及大面積使用易產(chǎn)生吸收毒性等不足而限制了其在臨床進(jìn)一步應(yīng)用。固體脂質(zhì)納米粒(solid lipid nanoparticles，SLN)是近年皮膚靶向性藥物載體研究的熱點(diǎn)，被認(rèn)為是脂質(zhì)體的下一代替代載藥制劑，局部給藥具有生理相容性好、可控制藥物釋放、良好的靶向性、可避免化學(xué)不穩(wěn)定藥物的降解及減少藥物對(duì)皮膚的刺激作用等多種優(yōu)點(diǎn)，因此，固

3、體脂質(zhì)納米粒作為藥物載體應(yīng)用于經(jīng)皮給藥系統(tǒng)具有良好的發(fā)展前景。目前，國(guó)內(nèi)外尚無全面、系統(tǒng)的關(guān)于PPT的皮膚毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究，PPT-SLN的基礎(chǔ)研究才剛剛起步，其局部應(yīng)用的安全性國(guó)內(nèi)外也未見報(bào)道。為了增加PPT在皮膚中的滯留量，增強(qiáng)其對(duì)病變組織的靶向作用，延長(zhǎng)其對(duì)病變細(xì)胞的作用時(shí)間，達(dá)到提高CA的治療效果并減少CA復(fù)發(fā)同時(shí)又盡可能降低其局部和全身毒副作用的目的，我們以毒性低、生物相容性好的固體脂質(zhì)材料一硬脂酸、十八烷酰胺為藥物載體吸附或包

4、裹PPT，以Brij78和大豆卵磷脂為混合表面活性劑，采用改良的乳化蒸發(fā)一低溫固化法研制了PVT-SLN，并對(duì)其制備工藝、質(zhì)量和經(jīng)皮應(yīng)用的安全性進(jìn)行了初步實(shí)驗(yàn)研究。 目的： 1．探討PPT-SLN的制備工藝。 2．對(duì)PPT-SLN的質(zhì)量進(jìn)行考察。 3．考察PPT-SLN經(jīng)皮膚用藥的安全性。 方法： 1．根據(jù)單因素考察和正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化處方，以硬脂酸、十八烷酰胺為固體脂質(zhì)載體，Bri378和

5、大豆卵磷脂為混合表面活性劑，采用改良的乳化蒸發(fā)-低溫固化法制備PPT-SLN。 2．用透射電鏡考察納米粒的形態(tài)；用Zeta-sizer粒徑分析儀檢測(cè)納米粒粒徑大小和電位；用高效液相色譜法測(cè)定納米粒中PPT的包封率；用PH計(jì)測(cè)定納米粒PH值。 3．選擇Wistar大鼠220只，F(xiàn)mmu豚鼠120只。采用相同配方制備0.05％PPT-SLN、0.1％PPT-SLN、0.5％PPT-SLN和空白SLN，并以0.5％PPT酊劑作

6、為對(duì)照。①取豚鼠40只，按隨機(jī)數(shù)字表法分成0.05％PPT-SLN、0.1％PPT-SLN、0.5％PPT-SLN、空白SLN及0.5％PPT酊劑完整皮膚組和破損皮膚組，每組4只，進(jìn)行單次給藥皮膚刺激試驗(yàn)。給藥方法：實(shí)驗(yàn)開始前24h豚鼠背部?jī)蓚?cè)對(duì)稱脫毛后用手術(shù)刀片作＃字劃痕，以滲血為度。采用同體左右側(cè)自身對(duì)照法，左側(cè)為受試區(qū)，分別取0.05％PPT-SLN、0.1％PPT-SLN、0.5％PPT-SLN、空白SLN混懸液及0.5％PPT

7、酊劑0.1mL均勻涂布于受試區(qū)，右側(cè)為空白對(duì)照區(qū)，再以自制單層塑料薄膜和雙層紗布封包受試區(qū)。分別于去除敷料和清洗受試物后1，24，48h觀察涂藥部位有無紅斑和水腫等情況，以及上述變化的恢復(fù)情況與時(shí)間。另取豚鼠40只，分組同單次皮膚刺激試驗(yàn)，進(jìn)行多次給藥皮膚刺激試驗(yàn)。皮膚處理方法、觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)指標(biāo)同單次皮膚刺激試驗(yàn)，每日給藥1次，連續(xù)給藥14d。②取大鼠110只，按隨機(jī)數(shù)字表法分成0.05％PPT-SLN、0.1％PPT-SLN、0.5

8、％PPT-SLN、空白SLN及0.5％PPT酊劑完整皮膚組和破損皮膚組及正常對(duì)照組，每組10只，進(jìn)行皮膚急性毒性試驗(yàn)。試驗(yàn)方法：脫毛后，分別取0.05％PPT-SLN、0.1％PPT-SLN、0.5％PPT-SLN、空白SLN混懸液及0.5％PPT酊劑1mL均勻涂布于受試區(qū)，連續(xù)觀察14d，每日觀察大鼠體重、進(jìn)食量、呼吸、體態(tài)、眼、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、四肢活動(dòng)、糞便性狀及死亡情況。另取大鼠110只，分組同皮膚急性毒性試驗(yàn)，進(jìn)行皮膚長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)

9、。皮膚處理方法及觀察指標(biāo)同皮膚急性毒性試驗(yàn)，每日給藥1次，藥量均為0.1mL，連續(xù)給藥30d，末次給藥后24h麻醉動(dòng)物，取血3～4mL進(jìn)行血液學(xué)、血液生化學(xué)檢查并切取各組大鼠涂藥中心區(qū)域的皮膚組織行皮膚病理檢查及激光共聚焦顯微鏡掃描。③取豚鼠40只，按隨機(jī)數(shù)字表法分成0.5％PVT-SLN組、0.5％PPT酊劑組、陰性對(duì)照組及陽性對(duì)照組，每組10只，進(jìn)行皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)。方法：脫毛后，4組左側(cè)脫毛區(qū)分別涂0.5％PPT-SLN混懸液、0

10、.5％PPT酊劑組、空白SLN混懸液及1％2，4，2-硝基氯苯0.1mL，涂藥后以自制單層塑料薄膜和雙層紗布封包受試區(qū)，6h后去除敷料和清洗受試物。第7d和第14d，以同樣方法各重復(fù)1次，共3次。于末次給受試物致敏后14d，將受試物0.1mL涂于豚鼠背部右側(cè)脫毛區(qū)，6h后去掉受試物，即刻觀察皮膚變態(tài)反應(yīng)情況，之后于24，48，72h再次觀察皮膚反應(yīng)。 4．統(tǒng)計(jì)分析：以SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以X±

11、S表示，兩組組間顯著性檢驗(yàn)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組組間顯著性檢驗(yàn)用One-way hnnova分析，當(dāng)P<0.05時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1．制備的PPT-SLN混懸液外觀為半透明、淡乳色、質(zhì)地均勻及帶淡藍(lán)色乳光的膠體狀分散體系。 2．透射電鏡下PPT-SLN基本呈圓形或橢圓形；Zeta-sizer粒徑分析儀檢測(cè)納米粒粒徑和電位分別為75.3nm±26.2nm、23.2mV±3.1mV；高效液相色譜法測(cè)定納

12、米粒中PPT的包封率為86.4％；PH計(jì)測(cè)定納米粒PH值為4.66±0.18。 3．實(shí)驗(yàn)大鼠220只，豚鼠120只，均進(jìn)入結(jié)果分析。PPT-SLN皮膚毒理學(xué)研究顯示：在有效觀察時(shí)間和一定濃度范圍內(nèi)①單次和多次給予PPT-SLN及其基質(zhì)對(duì)豚鼠皮膚均無刺激性；單次給予0.5％PPT酊劑對(duì)豚鼠完整皮膚無刺激性，對(duì)破損皮膚有較強(qiáng)的刺激性；多次給予0.5％PPT酊劑對(duì)豚鼠完整皮膚、破損皮膚均有較強(qiáng)的刺激性，其中破損皮膚組豚鼠皮膚刺激性出現(xiàn)

13、的最早和最嚴(yán)重。②0.5％PPT-SLN和0.5％PPT酊劑單次大劑量應(yīng)用時(shí)大鼠容易出現(xiàn)短期的系統(tǒng)吸收毒性，尤以皮膚破損組癥狀較明顯，其中0.5％PPT酊劑組大鼠中毒癥狀持續(xù)時(shí)間均較0.5％PPT-SLN組持久。0.05％PP7-SLN，0.1％PPI-SLN、空白SLN組大鼠應(yīng)用則相對(duì)安全未見系統(tǒng)吸收中毒癥狀。③小劑量長(zhǎng)期應(yīng)用PPT-SLN、空白SLN和PPT酊劑對(duì)大鼠比較安全無系統(tǒng)吸收毒性；應(yīng)用0.5％PPT-SLN、0.1％PPT

14、-SLN時(shí)大鼠可出現(xiàn)以表皮為主輕度的皮膚急性炎癥反應(yīng)，其中0.5％PPT-SLN組大鼠皮膚炎癥反應(yīng)出現(xiàn)得相對(duì)較早并可有毛發(fā)生長(zhǎng)障礙；應(yīng)用0.5％PPT酊劑時(shí)大鼠可出現(xiàn)重度皮膚全層急性炎癥反應(yīng)及明顯毛發(fā)生長(zhǎng)障礙。④PPT-SLN組大鼠藥物主要富集于表皮層和毛囊及其周圍而真皮及皮下組織藥物含量相對(duì)較少，較PPT酊劑組具有良好的皮膚靶向性；PPT-SLN組大鼠藥物在皮膚各層的富集量隨著藥物濃度的增加而增大。⑤PPT酊劑、PPT-SLN及其基質(zhì)