植物轉(zhuǎn)錄因子NAP的系統(tǒng)發(fā)育及其對葉片衰老的調(diào)控.pdf

1、NAP(NAC-Like，Activated by AP3/PI)是轉(zhuǎn)錄因子NAC家族中一個重要成員，簡稱NAP亞家族。NAP亞家族是植物所特有的轉(zhuǎn)錄因子，其在調(diào)控植物生長發(fā)育、響應(yīng)外界環(huán)境脅迫以及控制葉片衰老等方面有著重要的作用，尤其可以通過調(diào)控葉片衰老進(jìn)而影響植物的產(chǎn)量和品質(zhì)，這已引起科研工作者的關(guān)注。然而目前有關(guān)NAP亞家族的研究主要集中在擬南芥和水稻這些模式植物上，在非模式植物如棉花上的研究較少。棉花是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，在國民

2、經(jīng)濟(jì)中占有重要的地位，但有關(guān)NAP成員在棉花上的相關(guān)研究還未見深入的報道。因此本研究以NAP亞家族為切入點(diǎn)，首先對玉米以及其他植物中的NAP成員進(jìn)行研究，進(jìn)而推廣到棉花這一非模式植物上，并對陸地棉中一個NAP成員(GhNAP)與葉片衰老相關(guān)的功能及其調(diào)控機(jī)制進(jìn)行深入探究，全方位闡明GhNAP的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)程、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及調(diào)控葉片衰老的功能。研究的主要結(jié)果如下:
　　1.利用古多倍體植物玉米的基因組數(shù)據(jù)庫，分離到124個NAC成員，進(jìn)

3、一步將其劃分為13個NAC亞家族。全基因組復(fù)制事件尤其是額外的全基因組復(fù)制事件可能在ZmNAC擴(kuò)增中具有重要的作用。不同的亞家族有不同的擴(kuò)增速率，ZmNAC家族的擴(kuò)增集中出現(xiàn)在一些NAC亞家族中。另外，玉米的復(fù)制事件可能發(fā)生在玉米和谷子這兩個物種分化以后，并且片段復(fù)制事件在玉米的基因復(fù)制事件中扮演著重要的作用。ZmNAC的擴(kuò)增也與內(nèi)含子的獲得和缺失有關(guān)。在基因復(fù)制以后，復(fù)制基因發(fā)生了有限的功能分化。此外，玉米的NAP亞家族包含較少的成員

4、，未發(fā)生任何基因復(fù)制事件，并且其基因結(jié)構(gòu)以及內(nèi)含子相位相對保守，同時玉米中NAP成員的功能與其他植物中NAP成員的功能類似，這表明NAP成員的結(jié)構(gòu)和功能在玉米中可能是相對保守的。
　　2.通過對39種植物的全基因組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)197個NAP成員分布在31種維管束植物中，而在8種非維管束植物中并未發(fā)現(xiàn)NAP成員的存在。所有的NAP成員可以在進(jìn)化上分為兩組(NAPⅠ和NAPⅡ)，并且NAPⅠ的起源時間可能晚于NAPⅡ的起源時間。在物

5、種分化以后，物種內(nèi)的基因復(fù)制尤其是片段復(fù)制事件可能導(dǎo)致了NAP成員的擴(kuò)增，而且該擴(kuò)增還與內(nèi)含子的獲得和缺失有關(guān)。另外，在基因復(fù)制以后功能分化是有限的，同時也發(fā)現(xiàn)ABA在NAP亞家族調(diào)控的葉片衰老過程中可能發(fā)揮著很重要的作用。
　　3.在棉花中，采用電子克隆和傳統(tǒng)PCR克隆相結(jié)合的方法克隆出了與擬南芥AtNAP同源的NAP亞家族成員GhNAP，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GhNAP具有典型的NAP亞家族結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，即GhNAP包含相對保守的NAC區(qū)，并且

6、可以進(jìn)一步分為5個不同的亞區(qū)（A到E），同時其TAR區(qū)包含一個相對保守的NAPⅠ亞區(qū)。另外，對GhNAP在植物界中的進(jìn)化進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)GhNAP與擬南芥AtNAP聚在一個分枝上，都屬于NAPⅠ組成員。通過互補(bǔ)實驗發(fā)現(xiàn)GhNAP可以互補(bǔ)擬南芥atnap突變體的滯綠表型，這表明陸地棉中的GhNAP是擬南芥AtNAP的一個直系同源基因。
　　4.基因多拷貝現(xiàn)象在棉花中經(jīng)常存在，本研究發(fā)現(xiàn)GhNAP具有四個拷貝（GhNAP_a、GhNAP

7、_b、GhNAP_c和GhNAP_d），每一個拷貝都包括三個外顯子和兩個內(nèi)含子;并且GhNAP_a和GhNAP_b可能來源于A基因組祖先棉種，而GhNAP_c和GhNAP_d可能來源于D基因組祖先棉種;同時NAP成員在陸地棉中的數(shù)目擴(kuò)增是在種間雜交以后發(fā)生的，并非在祖先種中發(fā)生。此外，通過序列比對以及分化時間的分析發(fā)現(xiàn)，在GhNAP中，A亞基因組的拷貝更易轉(zhuǎn)變成D亞基因組的拷貝。對其功能進(jìn)行初步分析發(fā)現(xiàn)，GhNAP的功能與目前較為接近的

8、祖先棉種（亞洲棉和雷蒙德氏棉）中的NAP成員功能類似，但不同拷貝之間可能出現(xiàn)了一些功能的分化現(xiàn)象。
　　5.異位表達(dá)實驗表明，過表達(dá)GhNAP可以引起擬南芥葉片早衰，但在轉(zhuǎn)GhNAPi株系中，其葉片衰老現(xiàn)象得到適當(dāng)?shù)难泳?在棉花中，降低GhNAP的正常表達(dá)可以適當(dāng)延緩葉片衰老。相似的現(xiàn)象也出現(xiàn)在黑暗誘導(dǎo)葉片衰老的實驗中。因此，GhNAP可以在棉花中成為一個指示棉花葉片衰老進(jìn)程的衰老標(biāo)記基因，同時在自然和黑暗環(huán)境下GhNAP在葉片衰

9、老中均起著重要的作用。此外，在棉花中降低GhNAP的正常表達(dá)可以延緩葉片衰老，進(jìn)而對棉花的產(chǎn)量和品質(zhì)產(chǎn)生影響。
　　6.GhNAP具有轉(zhuǎn)錄激活活性，其轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域主要位于GhNAP中相對多樣化的TAR區(qū)。另外，GhNAP的亞細(xì)胞定位在細(xì)胞核處，這些結(jié)果表明GhNAP可能以轉(zhuǎn)錄因子的角色調(diào)控葉片衰老。通過對其啟動子、外源ABA響應(yīng)、內(nèi)源ABA含量以及ABA相關(guān)基因表達(dá)的分析，發(fā)現(xiàn)在GhNAP調(diào)控葉片衰老過程中，ABA發(fā)揮著重要的作用

10、。酵母單雜交實驗發(fā)現(xiàn)GhNAP的直接下游靶基因不是GhSAG113，這表明在調(diào)控葉片衰老中，棉花GhNAP以一種不同于擬南芥AtNAP的調(diào)控模式調(diào)控葉片衰老。
　　綜上所述，本研究利用比較基因組學(xué)的方法對玉米以及其他植物中的NAP成員進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)NAP亞家族在植物界中的結(jié)構(gòu)和功能具有一定的保守性。在此基礎(chǔ)上，從陸地棉中克隆出一個NAPⅠ組成員GhNAP，發(fā)現(xiàn)GhNAP在陸地棉中具有多拷貝現(xiàn)象，同時GhNAP可以通過ABA介導(dǎo)途徑