固相萃取-反相高效液相色譜法同時測定人血漿中五種苯二氮卓類藥物濃度及其臨床應(yīng)用.pdf

1、苯二氮卓類藥物為鎮(zhèn)靜、催眠、抗焦慮的臨床首選藥物，具有鎮(zhèn)靜催眠、抗焦慮、抗驚厥、抗癲癇、中樞性肌松等中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制的藥理作用。盡管有效安全，但長期使用該類藥物仍可致耐受性、依賴性，突然停藥也會引起撤藥綜合征；且大劑量可損害患者的近期記憶，引起暫時性的健忘癥，也可引起患者外周神經(jīng)肌肉阻斷等。本類藥物與其它藥物存在著相互作用，如：乙醇可增強(qiáng)苯二氮卓類藥物的不良反應(yīng)等。苯二氮卓類藥物一次濫用或長期使用都有可能引起急性或慢性中毒，特別是與其他

2、鎮(zhèn)靜劑混合使用時，中毒的可能性更大，因而也是急診藥物中毒的常見藥物。而且，與麻醉藥品相比，苯二氮卓類藥物品種繁多，較易獲得，使用廣泛，易致濫用和依賴。因此建立快速、簡便、準(zhǔn)確的體內(nèi)苯二氮卓類藥物分析檢測方法具有重要實用價值和意義，不僅可應(yīng)用于臨床對這類藥物進(jìn)行治療藥物監(jiān)測，觀察療效與不良反應(yīng)，以支持神經(jīng)、精神疾病的合理、安全用藥，而且也能為中毒藥物分析提供依據(jù)。
　　地西泮、奧沙西泮、氯硝西泮、三唑侖和阿普唑侖是臨床常用的五種苯二

3、氮卓類藥物。本類藥物結(jié)構(gòu)相似，極性相近，同時分離和測定此類藥物有一定難度；且生物樣品量一般都較少，而血樣中本類藥物的含量往往非常低（血藥濃度一般在 ng/mL-ug/mL之間）；有的藥物如地西泮還會在體內(nèi)產(chǎn)生奧沙西泮等一系列活性代謝產(chǎn)物，血液中藥物原形、體內(nèi)代謝產(chǎn)物與大量內(nèi)源性干擾物質(zhì)并存。因此，如何對樣本進(jìn)行預(yù)處理，以減少雜質(zhì)干擾，并對痕量組分進(jìn)行提取、分離、富集，以提高分析方法的靈敏度顯得尤為重要。氣-質(zhì)聯(lián)用或液-質(zhì)聯(lián)用用于分析本類

4、藥物，但由于儀器昂貴，很難在臨床得到廣泛應(yīng)用。高效液相色譜法廣泛地應(yīng)用于分析體內(nèi)本類藥物，具有快速、分離效果好、準(zhǔn)確度高的優(yōu)點?，F(xiàn)有的研究報道多是對其中一些藥物的測定，但沒有同時測定其活性代謝產(chǎn)物（如奧沙西泮），且多用傳統(tǒng)的液-液萃取法預(yù)處理血液樣本。而且有的方法較適合法醫(yī)學(xué)鑒定：用的樣本量較大，靈敏度較低，不適合于治療藥物監(jiān)測。
　　本文旨在建立專屬性強(qiáng)、靈敏度高、重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確可靠、操作簡便的固相萃取法預(yù)處理血液樣本，及等度洗

5、脫的反相高效液相色譜法，用二極管陣列檢測器同時測定人血漿中五種苯二氮卓類藥物，并以三環(huán)類抗抑郁藥氯丙咪嗪為內(nèi)標(biāo)，快速分析體內(nèi)本類藥物的濃度。本文含二個部分：以高效液相色譜法-二極管陣列檢測器同時分析測定五種臨床常用苯二氮卓類藥物的血藥濃度；用固相萃取法對人血漿樣品進(jìn)行預(yù)處理。
　　一、高效液相色譜法-二極管陣列檢測器同時分析測定五種臨床常用苯二氮卓類藥物的血藥濃度
　　方法：采用內(nèi)標(biāo)法定量。色譜條件如下：
　　色譜柱：

6、XTerra C8 RP（4.6×150mm，5um）分析柱，Waters公司
　　預(yù)柱：Zobax-Extend C18（4.6×10mm，5um），Agilent公司
　　流動相：乙腈：50mM磷酸緩沖液（pH3.0）=26.8：73.2（v/v）
　　流速：1.2mL/min
　　柱溫：45℃
　　DAD檢測器：220nm
　　進(jìn)樣量：50uL
　　結(jié)果：結(jié)果顯示，被測五個藥物的日內(nèi)誤差（

7、RSD）為2.2％-12.6%，日間誤差（RSD）為2.1%-13.0%。在較寬的范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系：奧沙西泮（7.5–2000 ng/mL）、地西泮（7.5–500 ng/mL）、氯硝西泮、阿普唑侖及三唑侖（5–200 ng/mL），相關(guān)系數(shù)均在0.9994以上。地西泮的最低檢測限為3.2ng/mL，奧沙西泮的最低檢測限為2.2ng/mL，氯硝西泮的最低檢測限為1.1ng/mL，阿普唑侖的最低檢測限為1.5ng/mL，三唑侖的最

8、低檢測限為1.4ng/mL。
　　結(jié)論：建立了等度洗脫的高效液相色譜法，可以在21min內(nèi)同時分離測定五種苯二氮卓類藥物，并以三環(huán)類抗抑郁藥氯丙咪嗪為內(nèi)標(biāo)，方法操作簡便、快速、精密度好、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適于臨床對血漿樣本中這類藥物含量的分析測定。
　　二、建立固相萃取法預(yù)處理血漿樣品
　　方法：采用C1 cartridges（100 mg，1 mL，Agilent公司），對血漿樣本進(jìn)行預(yù)處理，以提取、分離、富集待測藥物。

9、
　　柱子依次用5mL甲醇、5mL去離子水，進(jìn)行活化、平衡后，用pH=7的磷酸緩沖液稀釋血樣上柱；依次用1mL水、1mL水/甲醇混合液（80:20 v/v）洗去雜質(zhì)；用2mL甲醇洗脫、收集被測物；洗脫液在45℃氮氣下吹干，用流動相定容至125uL；離心，5℃，13000 rpm x5min，取上清液以備進(jìn)樣。
　　結(jié)果：六種藥物（包括內(nèi)標(biāo)氯丙咪嗪）的提取回收率為81-101%，RSD為2.1-13%。地西泮的最低檢測限為3.

10、2ng/mL，奧沙西泮的最低檢測限為2.2ng/mL，氯硝西泮的最低檢測限為1.1ng/mL，阿普唑侖的最低檢測限為1.5ng/mL，三唑侖的最低檢測限為1.4ng/mL。
　　結(jié)論：建立了固相萃取法對血漿樣本進(jìn)行預(yù)處理，可以有效提取樣本中五種苯二氮卓類藥物及內(nèi)標(biāo)氯丙咪嗪，回收率較高；選擇性較高，有效去除內(nèi)源性干擾；將待測藥物的濃度提高為原來的4倍，提高了分析方法的靈敏度。本方法操作簡便、精密度好、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適于臨床對血漿樣本