乙型肝炎病毒慢性感染對細(xì)胞色素P450 2C9表達(dá)的影響.pdf

1、乙型肝炎病毒感染是全球主要的公共安全問題之一,國內(nèi)有近10％的人口感染乙型肝炎病毒,感染者已超過1.2億。藥物在這類人群中的代謝規(guī)律是否跟正常人一致呢?是否會由于HBV感染影響藥物的代謝,從而導(dǎo)致藥物不良反應(yīng)(藥物性肝損害)的概率增加呢?這個問題一直是臨床關(guān)注的熱點,也是臨床醫(yī)學(xué)的一個盲區(qū)。 肝臟是藥物代謝的主要場所,肝臟進(jìn)行藥物代謝依賴于微粒體中的多種酶系,其中最重要的是細(xì)胞色素P450酶系。越來越多的證據(jù)表明,藥物代謝過程所

2、致肝損害與P450酶系密切相關(guān),任何導(dǎo)致P450酶活性變化的因素都可以影響藥物在體內(nèi)的代謝,其中,遺傳基因多態(tài)性和疾病的狀況是公認(rèn)的非常重要的因素?；蛲蛔兛梢杂脕斫忉屓藗冊诜盟幬飼r出現(xiàn)的藥效學(xué)和藥代學(xué)的個體差異,例如細(xì)胞色素P450亞家族CYP2C9酶,CYP2C9*2和CYP2C9*3突變基因能顯著降低酶活性。另一個影響酶活性的因素是疾病的狀況,對于慢性乙型肝炎患者而言,既往研究表明HBV可以對P450酶表達(dá)產(chǎn)生影響,但是HBV對

3、P450酶各主要亞家族酶活力的影響是不一致的,而且先前的工作大部分都是在動物和細(xì)胞水平進(jìn)行的,沒有HBV感染影響人肝細(xì)胞色素P450表達(dá)的研究。 由于CYP2C9在人類肝臟中含量豐富,占總量的20％,僅次于CYP3A,是肝內(nèi)含量第二的CYP亞家族酶,能代謝大約16％不同性質(zhì)的臨床藥物,并在前致癌物、前毒物和致突變劑的活化中起一定作用。既然CYP2C9酶在臨床藥物代謝中有如此重要的作用,那么慢性HBV感染時,CYP2C9酶的活性是

4、如何變化以及影響酶變化的機制是什么呢?這是我們關(guān)注的重點。本實驗選取CYP2C9酶作為研究對象,收集臨床肝臟標(biāo)本,檢測慢性HBV感染肝組織和無HBV感染的肝組織中CYP2C9酶的活性,并檢測該酶在mRNA水平和蛋白水平變化情況,同時在細(xì)胞水平對臨床研究結(jié)果進(jìn)行機制的探討,為慢性HBV感染患者安全合理使用藥物、規(guī)避不良反應(yīng)提供科學(xué)依據(jù)。 一、細(xì)胞色素P450 2C9基因多態(tài)性研究 目的：檢測CYP2C9基因型,排除CYP2

5、C9*2和*3突變等位基因?qū)YP2C9酶活性的影響,為下一步研究奠定基礎(chǔ)。 方法：收集慢性HBV感染患者和無HBV感染者的肝組織和血液標(biāo)本20例,以基因組DNA提取試劑盒提取血液基因組DNA,應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)對CYP2C9進(jìn)行基因分型,并隨機抽取數(shù)例樣本進(jìn)行TA克隆測序驗證。 結(jié)果：提取的血液基因組DNA光密度值在1.8～1.9之間,含量為90ng/μl～230ng/μl,

6、瓊脂糖凝膠電泳提示基因組完整,PCR-RFLP分析發(fā)現(xiàn)20例均為野生型CYP2C9(*1*1),未檢測到基因突變,TA克隆測序分析驗證了PCR-RFLP分析結(jié)果。 結(jié)論：本實驗中我們未檢測到CYP2C9突變基因,CYP2C9基因多態(tài)性的種族差異與地域不均衡性是結(jié)果最可能的解釋,但是為我們下一步檢測疾病對CYP2C9酶活性的影響奠定了基礎(chǔ)。 二、慢性乙型肝炎病毒感染對人肝細(xì)胞色素P450 2C9的影響 目的：探討慢

7、性HBV感染對人肝臟細(xì)胞色素酶2C9表達(dá)的影響,為慢性HBV感染患者安全用藥提供理論指導(dǎo)。 方法：慢性HBV感染患者和無HBV感染者的肝組織樣本,勻漿后差速離心法制備肝臟微粒體酶混合物(S9),以甲苯磺丁脲為探針,用高效液相色譜(HPLC)的方法檢測兩組樣本CYP2C9酶的活性,同時以RT-PCR和westem blot測定兩組肝組織樣本中mRNA和蛋白表達(dá)的差異。 結(jié)果：高效液相色譜顯示慢性HBV感染組Vmax為40.

8、4±10.4 pmol·mg-1·min-1,而無HBV感染對照組Vmax為52.6±13.4pmol·mg-1·min-1,兩組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0367),慢性HBV感染組和對照組米氏常數(shù)(Km)分別為263.5±66.4μmol/L和284.6±85.9μmol/L,兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.5471),RT-PCR和western blot顯示慢性HBV感染組CYP2C9 mRNA和蛋白的表達(dá)也較對照組明顯下降

9、(0.39±0.28 vs 0.65±0.13,0.26±0.13 vs 0.60±0.19),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0171,P=0.0002)。 結(jié)論：慢性HBV感染可以在mRNA和蛋白水平降低肝臟CYP2C9酶的表達(dá),導(dǎo)致酶活性下降,慢性HBV感染對CYP2C9酶活性的抑制作用是非競爭性的,對酶的結(jié)構(gòu)未造成影響。 三、乙型肝炎病毒X蛋白對細(xì)胞色素P450 2C9誘導(dǎo)的影響 目的：探討慢性HBV感染影響

10、CYP2C9表達(dá)調(diào)控的機制,為臨床合理用藥提供理論依據(jù)。 方法：培養(yǎng)HepG2細(xì)胞,選用利福平作為誘導(dǎo)劑,以MTT法檢測不同濃度的利福平對HepG2細(xì)胞的毒性作用,將乙型肝炎病毒X基因(HBX)插入pEGFP-N1中,構(gòu)建了pEGFP-X真核表達(dá)質(zhì)粒,將pEGFP-X和pEGFP-N1(轉(zhuǎn)染對照)轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,同時以利福平作為誘導(dǎo)劑,誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞CYP2C9表達(dá)72小時,分別用RT-PCR和western blot方

11、法,在mRNA和蛋白水平觀察HBx對利福平誘導(dǎo)CYP2C9表達(dá)的影響。 結(jié)果：MTT法檢檢測提示51μmol/L、10μmol/L、25μmol/L和50μmol/L利福平對于HepG2細(xì)胞均無細(xì)胞毒性,利福平能很好誘導(dǎo)CYP2C9的表達(dá),pEGFP-N1利福平誘導(dǎo)組和pEGFP-X利福平誘導(dǎo)組mRNA誘導(dǎo)表達(dá)量分別是空白細(xì)胞對照組的224％和163％,蛋白表達(dá)量分別是對照組的300％和245％,pEGFP-N1利福平誘導(dǎo)組和p

12、EGFP-X利福平誘導(dǎo)組mRNA表達(dá)量分別為0.387±0.015和0.282±0.032,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);兩組蛋白表達(dá)量分別為1.594±0.149和1.299±0.073,也有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。 結(jié)論：HBX可以干擾利福對HepG2細(xì)胞CYP2C9的誘導(dǎo),提示慢性HBV感染導(dǎo)致的CYP2C9活性降低以及mRNA、蛋白表達(dá)的下降可能是由于HBX在人肝細(xì)胞中表達(dá),干擾了CYP2C9表達(dá)所致。

13、小結(jié)：本課題通過收集慢性HBV感染患者和無HBV感染者的肝組織和血液標(biāo)本,采用PCR-RFLP方法檢測CYP2C9酶的基因多態(tài)性,以甲苯磺丁脲為探針底物,用HPLC方法檢測兩組肝組織樣本中CYP2C9的酶活性。以RT-PCR和western印跡法測定了兩組肝組織樣本中mRNA和蛋白的表達(dá)差異,證實了慢性HBV感染患者CYP2C9酶活性較無HBV感染者明顯下降,同時探討了這一現(xiàn)象的機制,發(fā)現(xiàn)HBx可以干擾利福平對CYP2C9的誘導(dǎo),提示H