高糖細胞模型的建立與中藥降糖作用及其機理初步研究.pdf

1、糖尿病系一組由于胰島素分泌缺陷及(或)其生物學作用障礙引起的以高血糖為特征的代謝性疾病。隨著人口老齡化，糖尿病的發(fā)病率逐年上升。目前糖尿病已成為繼腫瘤、心血管病之后危害人類健康的第三大疾病。 糖尿病是一種復合病因的綜合征，與遺傳、自身免疫及環(huán)境因素有關(guān)。現(xiàn)代醫(yī)學治療糖尿病以西藥為主，但這些藥物會出現(xiàn)繼發(fā)性失效且毒副作用較大，對糖尿病的并發(fā)癥的防治上也存在不足。而中藥以其毒副作用小、作用溫和持久、具有綜合治療作用以及可延緩并發(fā)癥等

2、優(yōu)點已經(jīng)受到人們的重視。但中藥量多且作用復雜，目前降糖中藥主要以動物模型來篩選。該方法存在實驗周期長且耗費大的缺點，為了尋找快捷有效的篩選降糖中藥的方法我們進行了以下的實驗研究：1、利用STZ制備糖尿病小鼠動物模型，觀察中藥R對糖尿病小鼠的治療作用；2、建立大鼠原代肝細胞培養(yǎng)技術(shù)，利用高糖濃度制備肝細胞損傷模型，以建立篩選降糖中藥的肝細胞模型；3、降糖中藥的篩選；4、探討有效的降糖中藥對細胞模型的治療機理；實驗結(jié)果如下。 1．中

3、藥R對糖尿病小鼠的治療作用 1．1 中藥R能夠明顯降低糖尿病小鼠血糖糖尿病模型小鼠血糖增加，而R大劑量組在給藥14天時糖尿病模型小鼠血糖明顯降低； 1．2 中藥R能夠改善糖尿病模型小鼠的一般狀況糖尿病模型小鼠的體重減低、飲食量和飲水量增加，而R組小鼠的體重增加、飲食量和飲水量有所降低，一般狀況得到明顯改善； 1．3 中藥R能夠改善糖尿病模型小鼠的病理損傷病理形態(tài)學觀察顯示，模型組小鼠胰島萎縮、胰島細胞數(shù)量減少，有

4、淋巴細胞浸潤，中藥R組小鼠的胰島數(shù)量明顯增多，胰島細胞大小基本正常，淋巴細胞浸潤程度減輕，提示R能夠改善模型小鼠的病理損傷； 2 大鼠原代肝細胞的分離及其形態(tài)學觀察 2．1 肝細胞的分離方法采用兩步灌流法分離SD大鼠肝細胞，在無菌狀態(tài)下打開腹腔，經(jīng)門靜脈插管，先以流速為30ml/min灌流液開放灌注：10min后，改用37℃、0.05％的膠原酶溶液(50ml)以相同速度進行循環(huán)灌流10min，剪碎肝臟后水浴搖床20min

5、(200轉(zhuǎn)/min，37℃)臺盼蘭染色確定肝細胞的即時存活率。 2．2 肝細胞形態(tài)學觀察新鮮分離的離體肝細胞前景干凈，呈單個分散狀態(tài)，圓形、透亮、具有立體感。培養(yǎng)2小時肝細胞開始貼壁。12小時后大約有90％以上的細胞貼壁生長，貼壁24小時后細胞形態(tài)發(fā)生改變，呈典型的上皮樣多角形形態(tài)，胞體變平變薄，體積明顯增大，細胞間出現(xiàn)索狀或肝板狀連接。胞核清晰可見雙核或多核肝細胞。培養(yǎng)48小時后肝細胞肝細胞死亡較多，形態(tài)呈多角形形態(tài)，胞核清晰

6、可見多核和雙核肝細胞。 3 高糖損傷肝細胞模型的建立 3．1 模型制備方法采用高濃度葡萄糖(25mmol/L)刺激法，用含25mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)SD大鼠原代肝細胞，連續(xù)24小時。 3．2 細胞模型的病態(tài)表現(xiàn) 3．2．1造模過程中我們動態(tài)觀察了培養(yǎng)基中葡萄糖濃度的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組培養(yǎng)基中葡萄糖濃度的降低程度從造模12h開始明顯低于正常組，說明高糖環(huán)境可以使肝細胞利用葡萄糖的能力降低。

7、 3．2．2造模過程中我們利用MTT法檢測細胞OD值來反應肝細胞活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組肝細胞活性從造模6h開始明顯低于正常組。 以上結(jié)果說明，本研究復制的篩選降糖中藥的細胞模型中肝細胞利用葡萄糖的能力和肝細胞活性明顯降低，利用此模型篩選降糖藥物能夠較好的反映藥物對肝細胞利用葡萄糖能力的影響和藥物對肝細胞的保護作用。 4 篩選有效的降糖中藥 通過大量的文獻閱讀，我們選取了六種已報道的具有降糖作用的六種中藥組分：Rg、

8、Rt、Dg、Dt、Tg、Tt，利用建立的篩選降糖中藥的細胞模型，對其降糖效果和對肝細胞的保護作一評價。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Rg、Rt、Dg、Dt有明顯的降低培養(yǎng)基中葡萄糖濃度的作用，對肝細胞也有一定的保護作用。Tg、Tt在這兩方面的作用與模型組相比均沒有差異。故本研究對Rg、Rt、Dg、Dt的降糖機理作進一步探討。 5 R g、Rt、Dg、Dt的降糖機理研究 本實驗采用RT-PCR法研究Rg、Rt、Dg、Dt對肝臟糖代謝關(guān)鍵酶糖原

9、合成酶和葡萄糖6磷酸酶mRNA表達量的影響。結(jié)果顯示，模型組糖原合成酶mRNA表達降低，葡萄糖6磷酸酶的兩種亞基葡萄糖6磷酸酶催化亞基(G-6-PC)和葡萄糖6磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)運亞基(G-6-PT)mRNA表達增高，與正常組相比統(tǒng)計學差異顯著。Rg和Rt能明顯增加肝細胞胞糖原合成酶mRNA表達，與模型組相比統(tǒng)計具有顯著性差異，但對G-6-PC和G-6-PTmRNA表達沒有影響；Dg和Dt能明顯增高肝細胞胞糖原合成酶mRNA表達，能明顯降低G

10、-6-PC和G-6-PTmRNA表達，與模型組相比統(tǒng)計學差異顯著。 通過本研究，我們首先在動物模型上驗證了中藥R對糖尿病的治療作用，然后利用高糖刺激肝細胞，首次建立了一種能夠篩選降糖中藥的高糖損傷細胞模型，此模型具有簡單、經(jīng)濟、耗時短等優(yōu)點：并且利用此模型驗證了Rg、Rt、Dg、Dt的降糖效果；然后對這四種組分進行了初步的降糖機理研究，Rg、Rt、Dg、Dt通過影響肝臟糖代謝而實現(xiàn)降糖作用，這為臨床用藥提供了科學依據(jù)，也為后期開