VN對高糖培養(yǎng)下HUVEC作用的初步探討.pdf

1、目的:
　　 1.觀察高糖培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(humanumbilicalveinendothelialcells,HUVEC)中玻連蛋白(vitronectin,VN)表達(dá)水平的改變,細(xì)胞微絲骨架結(jié)構(gòu)的變化,以及細(xì)胞遷移能力、成管能力的變化;
　　 2.檢測VN表達(dá)水平改變對高糖培養(yǎng)下HUVEC中骨架結(jié)構(gòu)、細(xì)胞遷移、細(xì)胞成管能力的影響。
　　 方法:
　　 第一部分:
　　 建立高糖培養(yǎng)的H

2、UVEC體外模型,并常規(guī)培養(yǎng)HUVEC作為正常對照,實(shí)驗(yàn)分為組1(正常組:用含葡萄糖濃度為25mmol/L的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)HUVEC)和組2(高糖組:用含葡萄糖濃度為50mmol/L的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)HUVEC))。分別使用WesternBlot檢測兩組中VN的蛋白表達(dá)情況,利用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)合熒光顯微鏡觀察兩組中細(xì)胞微絲骨架的變化,用劃痕法檢測細(xì)胞遷移能力的改變,Matrigel方法觀察細(xì)胞成管情況。利用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對

3、組1和組2的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。
　　 第二部分:
　　 高糖培養(yǎng)HUVEC,利用干擾RNA技術(shù)干擾VN的表達(dá),實(shí)驗(yàn)分為組2(高糖組:用含葡萄糖濃度為50mmol/L的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)HUVEC))、組3(陰性干擾組:用controlSiRNA預(yù)干擾HUVEC,再用含葡萄糖濃度為50mmol/L的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng))和組4(陽性干擾組:用VNSiRNA預(yù)干擾HUVEC,再用含葡萄糖濃度為50mmol/L的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng))

4、。重復(fù)WesternBlot實(shí)驗(yàn)、免疫熒光實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、Matrigel實(shí)驗(yàn)。利用單因素方差分析中的LSD檢驗(yàn)對組2、組3、組4的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。
　　 結(jié)果:
　　 第一部分:
　　 1.WesternBlot結(jié)果顯示,在分組培養(yǎng)的0h時(shí),組1和組2中的VN蛋白表達(dá)量分別是(1.098±0.085)、(1.091±0.068),兩組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t1,2=0.111,P1,2＞0.05);在分組培養(yǎng)的

5、24h時(shí),組1和組2中VN的蛋白表達(dá)量分別為(0.893±0.119)(1.295±0.080),兩組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t1,2=-4.857,P1,2＜0.05);48h時(shí)組1和組2中vN的蛋白表達(dá)量分別為(0.874±0.115)(1.724±0.098),兩組之間的差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t1,2=-9.710,P1,2＜0.05)。
　　 2.免疫熒光結(jié)果顯示,在24h和48h時(shí),組2中都伴有更加明顯的細(xì)胞微絲骨架結(jié)構(gòu)

6、的改變。
　　 3.劃痕法表明,24h時(shí)組1和組2中遷移入劃痕的細(xì)胞數(shù)分別為(198.000±15.880)(242.000±11.130)個(gè),兩組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t1,2=-5.495,P1,2＜0.05);48h時(shí)組1和組2中遷移入劃痕的細(xì)胞數(shù)分別為(293.000±8.681)(334.000±10.863)個(gè),兩組之間的差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t1,2=-7.193,P1,2＜0.05)。
　　 4.Matr

7、igel法證實(shí),6h時(shí)組2中形成的閉合管腔數(shù)目(120.000±9.813)多于組1(91.000±9.867),兩組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t1,2=-5.163,P1,2＜0.05);12h時(shí)組2中形成的閉合管腔數(shù)目(19.000±3.209)也多于組1(8.000±3.011),兩組之間的差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t1,2=-5.659,P1,2＜0.05)。
　　 第二部分:
　　 1.WesternBlot結(jié)果顯示,

8、高糖培養(yǎng)Oh時(shí)組2、組3、組4中的vN蛋白表達(dá)量分別為(1.091±0.068)(1.002±0.029)(1.104±0.144),三組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.064,P＞0.05);高糖培養(yǎng)24h時(shí)組2、組3、組4中的VN蛋白表達(dá)量分別為(1.295±0.080)(1.078±0.090)(0.859±0.1150),三組之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(LSD2,3=0.217,P2,3＜0.05;LSD2,4=0.435,P2,

9、4＜0.05;LSD3,4=0.219,P3.4＜0.05);48h時(shí)組2、組3、組4中的VN蛋白表達(dá)量也依次降低(1.724±0.098)(1.148±0.163)(0.693±0.167),三組之間的差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(LSD2,3=0.576,P2,3＜0.05;LSD2,4=1.031,P2,4＜0.05;LSD3,4=0.455,P3,4＜0.05)。
　　 2.免疫熒光結(jié)果顯示,24h時(shí)組2中的細(xì)胞微絲骨架結(jié)構(gòu)最為明

10、顯,組3次之,組4最不顯著;48h時(shí)細(xì)胞微絲骨架分布亦然。
　　 3.劃痕實(shí)驗(yàn)表明,高糖培養(yǎng)24h時(shí)組2、組3、組4中遷移入劃痕的細(xì)胞數(shù)量依次減少(242.000±11.130)(199.000±7.055)(170.000±9.070),三組之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(LSD2,3=42.833,P2,3＜0.05;LSD2,4=71.333,P2,4＜0.05;LSD3,4=28.500,P3,4＜0.05);48h時(shí)組2、組

11、3、組4中遷移入劃痕的細(xì)胞數(shù)量分別為(334.000±10.863)(265.000±22.554)(227.000±12.613),三組之間的差異也均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(LSD2,3=68.667,P2,3＜0.05;LSD2,4=107.500,P2,4＜0.05;LSD3,4=38.833,P3,4＜0.05)。
　　 4.Matrigel法檢測,高糖培養(yǎng)6h時(shí)組2、組3、組4中細(xì)胞形成的血管腔數(shù)目依次為(120.000±9.8

12、13)(88.000±6.976)(55.000±8.886),三組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(LSD2,3=3.283,P2,3＜0.05;LSD2,4=6.567,P2,4＜0.05;LSD3,4=3.283,P3,4＜0.05);12h時(shí)組2、組3、組4中細(xì)胞形成的血管腔數(shù)目也依次減少(19.000±3.209)(14.000±1.789)(8.000±3.578),三組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(LSD2,3=4.500,P2,3＜0.

13、05;LSD2,4=1.050,P2,4＜0.05;LSD3,4=6.000,P3,4＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.高糖可誘導(dǎo)HUVEC中VN表達(dá)增高,并伴有細(xì)胞骨架重塑、細(xì)胞遷移能力增加、細(xì)胞成管能力增強(qiáng)。
　　 2.抑制VN的表達(dá)可導(dǎo)致高糖環(huán)境中HUVEC細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)改變、細(xì)胞遷移能力降低、細(xì)胞成管能力下降。
　　 3.VN可能是糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabeticretinopathy,DR